B9d1-flox 基因敲除小鼠

B9d1基因是一种编码B9结构域蛋白的基因，属于B9家族。B9结构域是一种保守的蛋白质结构域，存在于多种细胞中，与细胞信号传导和细胞器形成有关。B9d1基因的突变与多种疾病有关，包括Meckel综合征（MKS）、Joubert综合征（JS）、VATER/VACTERL综合征等。

Meckel综合征是一种常染色体隐性遗传病，主要特征为多囊肾、中枢神经系统缺陷、多指和肝纤维化。MKS被认为与初级纤毛的缺陷有关，因此被归类为纤毛病。目前，已发现与MKS相关的六个基因，包括MKS1、TMEM67、TMEM216、CEP290、CC2D2A和RPGRIP1L。然而，对这些基因的突变筛查发现，只有一半以上的MKS患者（46个家庭）中检测到两个突变的等位基因，这表明MKS具有更高的遗传异质性。为了探索MKS的完整遗传复杂性，研究人员对31个纤毛病基因进行了外显子富集的下一代测序，并在12个MKS家系中检测到一个新的MKS基因B9D1的剪接供体位点改变。B9D1蛋白在结构上与MKS1相似，并且已证明对秀丽线虫的纤毛形成至关重要。胎儿的RNA反转录酶-PCR分析显示，B9D1外显子4的移码缺失导致单个较小的mRNA产物。阵列CGH分析显示，第二个突变是一个1.713 Mb的新发缺失，完全删除了B9D1等位基因。免疫荧光分析突出了与对照相比，患者细胞的纤毛水平显著降低，证实了B9D1在纤毛形成中的作用。该胎儿还继承了一个B9D1的第二个MKS基因CEP290的可能的致病性新发错义突变，p.R2210C，这表明该疾病具有寡基因遗传特征[1]。

Joubert综合征是一种常染色体隐性遗传病，其特征为小脑和脑干畸形，以及多器官受累。JS的发生是由于34个已鉴定基因中的一个的双等位基因突变，所有这些基因编码初级纤毛的蛋白质成分。JS的临床表现非常多样，但可以通过轴向脑MRI上存在磨牙征、婴儿期肌张力低下和发育迟缓来建立临床诊断。与MKS相比，JS是一种较轻的纤毛病。最近的一份报告描述了一个有趣的JS病例，其中在B9D1中发现了两种新的突变。该基因通常与JS无关，但通常与MKS有关。功能mRNA研究有助于阐明这些新变种在病例中的致病作用[2]。

全基因组CRISPR筛选发现，B9d1基因是小鼠肝脏肿瘤形成的抑制因子。研究人员使用CRISPR介导的基因组编辑对小鼠进行了全基因组筛选，以确定肝脏肿瘤形成的抑制因子或致癌基因。他们使用CRISPR/Cas9技术对p53-null小鼠胚胎肝脏祖细胞进行了全基因组敲除筛选，并使用mGeCKOa慢病毒文库感染了67,000个单引导RNA（sgRNA），针对20,611个小鼠基因。将转导的细胞皮下移植到裸鼠中，一个月内，所有接受sgRNA文库的鼠都形成了皮下肿瘤。他们进行了高通量测序，以鉴定与初始细胞池相比至少增加8倍的sgRNA。为了验证从该筛选中获得的10个顶级候选肿瘤抑制因子，他们收集了来自肝癌患者（HCC）的Cancer Genome Atlas和COSMIC数据库的数据。他们使用CRISPR在p53-/-;Myc;Cas9细胞中灭活候选肿瘤抑制因子基因，并将它们皮下移植到裸鼠中；通过组织学和免疫组化监测肿瘤形成。具有肝脏特异性p53破坏的小鼠接受了编码Myc和sgRNA/Cas9的质粒的尾静脉注射，以破坏候选肿瘤抑制因子；监测肿瘤和转移的生长。他们比较了sgRNA/Cas9破坏肿瘤抑制因子基因的肝细胞与未破坏的肝细胞的基因表达谱。他们发现，在肝脏肿瘤抑制因子缺失后上调的基因在肝癌细胞系中进行了检查；它们的表达被短发夹RNA下调，并在裸鼠中检查了肿瘤生长。他们还检查了MEK抑制剂AZD6244、U0126和trametinib，或多功能激酶抑制剂索拉非尼对人类和鼠类HCC细胞系的影响。他们发现了4个与肝脏肿瘤形成相关的候选肝脏肿瘤抑制因子基因，这些基因以前与肝脏癌无关（Nf1、Plxnb1、Flrt2和B9d1）。CRISPR介导的Nf1敲除在小鼠中加速了肝脏肿瘤的形成。Nf1的丢失或RAS的致癌激活上调了肝脏祖细胞标记HMGA2和SOX9。RAS通路抑制剂抑制了由于Nf1丢失或RAS致癌激活而导致的Hmga2和Sox9基因的激活。HMGA2的下调延迟了表达致癌RAS的细胞形成的异种移植肿瘤的形成。在人类HCC中，NF1信使RNA水平低或HMGA2信使RNA水平高与患者存活时间较短相关。Plxnb1、Flrt2和B9d1的灭活导致小鼠肿瘤形成增加，并且激酶激活蛋白激酶磷酸化水平升高。使用CRISPR策略，他们确定了Nf1、Plxnb1、Flrt2和B9d1作为肝脏肿瘤形成的抑制因子。他们验证了RAS信号传导，通过有丝分裂原激活蛋白激酶，在小鼠中参与形成肝脏肿瘤的观察。他们还将NF1水平的降低与其下游蛋白HMGA2水平的升高与HCC患者的存活时间相关联。抑制或减少HMGA2的策略可能被开发出来，用于治疗肝癌症患者[3]。

Joubert综合征是一种临床和遗传上异质的纤毛病，特征为典型的脑小脑和脑干畸形（“磨牙征”），以及多器官受累。迄今为止，已在JS中发现24个基因突变，其中13个也导致MKS，这是一种致命的纤毛病，涉及肾脏、肝脏和骨骼。在这里，他们描述了4名患者，他们具有轻微的Joubert表型，并携带在MKS中只有MKS1或B9D1的致病突变，这两个基因以前只与MKS有关[4]。

纤毛是细胞质膜突起，在真核生物中作为细胞天线和推进器。为了实现它们的感官和运动功能，纤毛维持与细胞体不同的蛋白质和脂质组成。转换区（TZ）是位于纤毛基部的专门区域，其功能是作为分离纤毛内部和外部的屏障。TZ由许多跨膜和可溶性蛋白组成。MKS1、B9域（B9D）1/MKS9和B9D2/MKS10是可溶性TZ蛋白，由MKS的致病基因编码，并具有共同的B9D。他们在这里证明了这些B9D蛋白的相互作用模式为MKS1-B9D2-B9D1，并证明了它们相互依赖地定位到TZ。对MKS1敲除（KO）和B9D2-KO细胞的表型分析表明，B9D蛋白参与正常纤毛生物发生，但并非必需。这些KO细胞的拯救实验表明，B9D蛋白复合物的形成对于为纤毛膜蛋白创造扩散屏障至关重要[5]。

使用RNAi筛选、蛋白质组学、细胞生物学和鼠遗传学方法，他们已经确定了由九个蛋白组成的复合物，其中七个在人类纤毛病中受损。一个跨膜成分TMEM231在纤毛运输之前独立地定位到基体，并以Septin 2（Sept2）调节的方式定位。TMEM231、B9D1（B9结构域蛋白1）和CC2D2A（螺旋-螺旋和C2结构域蛋白2A）在TZ的定位相互依赖，并依赖于Sept2。在体外破坏该复合物会导致纤毛形成的减少和剩余纤毛中信号受体丢失。B9D1和TMEM231的小鼠敲除具有相同的Sonic hedgehog（Shh）信号传导和纤毛形成缺陷。引人注目的是，破坏该复合物会增加扩散到纤毛膜的速度和纤毛中质膜蛋白的数量。他们描述的复合物对于正常纤毛功能是必不可少的，并作为扩散屏障，以维持纤毛膜作为分区的信号器官[6]。

VATER/VACTERL综合征是指以下成分特征（CFs）的非随机关联：椎体缺陷（V）、肛门直肠畸形（ARM）（A）、心脏异常（C）、气管食管瘘伴或不伴食管闭锁（TE）、肾脏畸形（R）和肢体异常（L）。临床诊断要求至少存在三个CFs，仅表现两个CFs的个体被归类为VATER/VACTERL样。大多数VATER/VACTERL个体显示肾脏表型。迄今为止，FGF8、FOXF1、HOXD13、LPP、TRAP1、PTEN和ZIC3的变异与VATER/VACTERL关联有关；然而，大规模重测序只能证实TRAP1和ZIC3为VATER/VACTERL疾病基因，这两个基因都与肾脏表型有关。在这项研究中，他们对21名个体及其家庭进行了外显子测序，这些个体及其家庭具有肾脏VATER/VACTERL或VATER/VACTERL样表型，以确定潜在的新的遗传原因。外显子分析在6个个体（29%）中鉴定出B9D1、FREM1、ZNF157、SP8、ACOT9和TTLL11中的双等位和X染色体半合子潜在致病性变异。在线工具GeneMatcher发现另一个个体在ZNF157中有变异。他们的研究建议有6个双等位和X染色体半合子VATER/VACTERL疾病基因，这表明所有六个基因都与人类肾脏畸形有关[7]。

骨关节炎（OA）是世界上最常见的退行性疾病之一。许多研究人员正在研究OA的发病机制，然而，它仍然不清楚。OA相关枢纽基因的筛选和验证是探索其潜在分子机制的重要组成部分。因此，这项研究旨在通过生物信息学、qPCR、荧光和碘化丙啶染色来探索和验证OA中的枢纽基因的机制。从Gene Expression Omnibus（GEO）中收集了微阵列数据集GSE43923、GSE55457和GSE12021，包括45个样本，分为23个OA膝关节样本和22个正常膝关节样本。 thereafter，265个差异表达基因（DEGs）被确定为所有，分为199个上调基因和66个下调基因。枢纽基因MAPK-14、PTPRC、PTPN12上调，而B9D1下调。为了进一步证实筛选差异基因在人软骨细胞中的表达，从关节置换手术中提取了人软骨细胞，并用甲苯胺蓝染色进行鉴定。与正常软骨细胞相比，OA软骨细胞COL I蛋白表达升高，COL II蛋白表达降低。OA软骨细胞中MAPK-14、PTPRC和PTPN12的表达水平显著高于正常软骨细胞中B9D1的表达水平。此外，与正常软骨细胞相比，OA软骨细胞的炎症坏死通过碘化丙啶染色增加。MAPK-14的高表达作为软骨细胞死亡和OA过程的促进剂，是一个重要的信号[8]。

Joubert综合征（JBS）是一种罕见的神经发育障碍，属于纤毛疾病组。JBS在遗传上异质，迄今为止已发现20个以上致病基因。JBS的分子诊断对于预测疾病进展和遗传咨询至关重要。他们开发了一种针对下一代测序（NGS）的方法，用于并行测序22个已知的JBS基因和599个其他纤毛基因。这种方法用于对51例表型良好的北欧JBS病例进行基因分型（在某些病例中，已对单个JBS基因进行了Sanger测序）。总共51个病例中有21个（41%）在已知的JBS基因中携带双等位致病突变，包括14个以前未描述的突变。C5orf42（12%）、TMEM67（10%）和AHI1（8%）的突变最常见。C5orf42突变导致纯粹的神经Joubert表型，在一例病例中与后轴多指畸形相关。他们的研究代表了一个未富集近亲婚配的JBS患者人群，为北欧人群不同JBS基因的相对重要性提供了见解。C5orf42突变相对频繁（可能是由于荷兰创始人突变），而与全球队列相比，CEP290突变不足。此外，他们报道了一例CC2D2A和B9D1杂合突变的病例，该基因与更严重的Meckel-Gruber综合征有关，最近被发表为潜在的新的JBS基因，并讨论了这一发现的意义[9]。

功能冗余的B9蛋白和秀丽线虫纤毛形成的肾囊肿素。Meckel-Gruber综合征（MKS）、肾囊肿素（NPHP）和Joubert综合征（JBTS）是一组具有部分重叠位点的异质囊肿性肾脏疾病。与这些疾病相关的许多蛋白质相互作用并定位于纤毛和/或基体。这些蛋白质之一是MKS1，它在一些MKS患者中受损，并包含一个B9基序，该基序在两个其他哺乳动物蛋白B9D2和B9D1中存在，其功能尚不清楚。秀丽线虫也有三个B9蛋白：XBX-7（MKS1）、TZA-1（B9D2）和TZA-2（B9D1）。在这里，他们报告秀丽线虫B9蛋白形成定位于纤毛基部的复合物。B9基因的突变除非与nph-1或nph-4的突变相结合，否则不会明显影响纤毛形成，nph-1和nph-4是人类基因（NPHP1和NPHP4，分别）的同源基因，这些基因在NPHP患者中受损。他们的数据表明，B9蛋白与肾囊肿素功能冗余，以调节纤毛和/或基体的形成和/或维持。这些数据表明，人类新发现的B9基因B9D2和B9D1的同源基因将是人类MKS、NPHP和JBTS病理学的强候选位点[10]。

综上所述，B9d1基因编码的B9结构域蛋白在细胞信号传导和细胞器形成中发挥重要作用。B9d1基因的突变与多种疾病有关，包括Meckel综合征、Joubert综合征、VATER/VACTERL综合征等。B9d1蛋白与MKS1、B9D2等蛋白质相互作用，参与纤毛的形成和维持，并作为扩散屏障保护纤毛膜。此外，B9d1基因的突变还与肝脏肿瘤形成、骨关节炎等疾病的发生发展相关。对B9d1基因的研究有助于深入理解纤毛功能障碍引起的疾病的发病机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。