Ecsit-flox 基因敲除小鼠

Ecsit（Evolutionarily Conserved Signaling Intermediate in Toll pathways）是一种细胞质适配蛋白，在Toll样受体（TLRs）信号介导的先天免疫反应中起着重要作用。Ecsit通过激活NF-κB信号通路和增强Retinoic acid-induced gene Ⅰ（RIG-Ⅰ）/ mitochondrial antiviral-signaling protein（MAVS）通路介导的先天抗病毒免疫来调节先天免疫反应[2]。此外，Ecsit还参与调节线粒体形态和功能，包括线粒体复合体Ⅰ（CⅠ）组装、线粒体活性氧（mROS）产生、线粒体膜电位（MMP）维持和线粒体质量控制[2]。

在病毒感染和肿瘤发生过程中，记忆CD8+ T细胞起着关键作用，它们能够快速响应重复抗原暴露。Ecsit是记忆CD8+ T细胞分化的重要介导因子。T细胞中Ecsit的缺失导致富马酸合成丧失，并通过组蛋白去甲基化酶KDM5去甲基化TCF-1启动子来抑制TCF-1表达，从而以细胞内在的方式损害记忆CD8+ T细胞的发育[1]。Ecsit的表达与干细胞样记忆祖细胞耗尽的CD8+ T细胞相关，并与癌症患者的生存率呈正相关[1]。Ecsit介导的富马酸合成刺激TCF-1活性，促进记忆CD8+ T细胞在病毒感染和肿瘤发生过程中的发育，并突出了治疗性富马酸类似物和PD-L1抑制在肿瘤免疫治疗中的效用[1]。

Ecsit在多种生理和病理条件下发挥作用，包括胚胎发育、炎症、心脏功能和线粒体复合体Ⅰ的组装。Ecsit还与多种信号中间体相互作用，如肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）和视黄酸诱导基因1（RIG-Ⅰ），并调节细胞微环境中的各种通路[3]。Ecsit的分子功能细节在病理生理学中仍然不清楚[3]。Ecsit在多种疾病的发生和病理中发挥作用，包括阿尔茨海默病（AD）、心脏肥大、骨骼肌肉分解、癌症、结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤（ENKTL）和缺血性中风[2]。

Ecsit的V140A突变导致超炎症和促进结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤（ENKTL）中的噬血细胞综合征（HPS）。Ecsit-V140A比野生型蛋白具有更强的NF-κB激活能力，因为它对S100A8和S100A9异源二聚体的亲和力增加，从而促进NADPH氧化酶活性[4]。Ecsit-T419C敲入小鼠在LPS刺激下表现出比野生型Ecsit小鼠更高的腹膜NADPH氧化酶活性。Ecsit-T419C转染的ENKTL细胞系产生肿瘤坏死因子（TNF）-α和干扰素（IFN）-γ，导致细胞培养和鼠异种移植中的巨噬细胞活化和大量细胞因子分泌。在ENKTL患者中，ECSIT-V140A与NF-κB的激活、更高的HPS发病率和较差的预后相关[4]。免疫抑制剂沙利度胺可防止NF-κB结合到其靶基因的启动子（包括TNF和IFNG），沙利度胺和地塞米松联合治疗可延长移植了ECSIT-T419C转染的ENKTL细胞的鼠的生存期[4]。这些发现为ENKTL相关HPS提供了机制见解和潜在的治疗策略[4]。

Ecsit是心脏功能的关键限制因素。Ecsit在早期发育、转录因子NF-κB的激活和促进清除细胞内细菌（如沙门氏菌）的线粒体活性氧（mROS）的产生中发挥作用。Ecsit也是线粒体复合体Ⅰ的重要组装因子[5]。与小鼠形式的Ecsit（mEcsit）不同，我们证明人类Ecsit（hECSIT）具有高度的易变性。为了研究hECSIT的不稳定性是否影响其小鼠同源物的先前归因的功能，我们创建了一种潜在的转基因小鼠，其中小鼠Ecsit基因被人类ECSIT基因所取代。人类化小鼠的hECSIT蛋白水平较低，与其固有的不稳定性一致。虽然hECSIT的低水平表达能够完全弥补mEcsit在早期发育和NF-κB通路激活方面的作用，但人类化小鼠的巨噬细胞在清除沙门氏菌方面受损，这与mROS的产生减少有关。值得注意的是，在老年人类化小鼠中表现出严重的心脏肥大，导致过早死亡。通过显示hECSIT蛋白的低水平导致线粒体复合体Ⅰ的组装和活性显著降低，氧化磷酸化受损和ATP产生减少，阐明了这种表型的细胞和分子基础。人类化hECSIT小鼠的心脏组织也显示出线粒体融合减少和裂解增加，但清除碎片化线粒体的能力受损。还证明了Ecsit在心肌细胞中线粒体功能和心脏保护中的内在作用。我们还表明，心脏纤维化和人类心脏损伤与人类ECSIT的低表达相关。总之，我们的研究确定了ECSIT在心脏保护中的作用，并生成了一个有价值的实验模型来研究线粒体功能障碍和心脏病理生理学[5]。

在骨骼形成和再生中，Ecsit在骨骼祖细胞中起着关键作用。骨骼祖细胞提供形成骨形成成骨细胞的储备，但其骨形成的主要能量来源仍然不清楚。我们证明了线粒体氧化磷酸化在骨骼祖细胞的成骨分化和分化中是必需的。骨骼祖细胞中ECSIT的缺失阻碍了骨形成和再生，导致骨骼畸形、骨髓生态位缺陷和自发性骨折后持续的非愈合。在骨骼骨折后，Ecsit缺乏的骨骼祖细胞迁移到相邻的骨骼肌，导致肌肉萎缩。这些表型是ECSIT在骨骼祖细胞中功能的内在特征，因为在成熟的成骨细胞中缺乏Ecsit的小鼠中几乎观察不到骨骼异常。机制上，骨骼祖细胞中Ecsit的缺失损害了线粒体复合体的组装和线粒体氧化磷酸化，并提高了糖酵解。通过体内重组野生型ECSIT表达，ECSIT相关的骨骼表型得到逆转，而带有缺陷的线粒体定位突变的突变体则没有逆转。总的来说，这些发现确定了线粒体氧化磷酸化是骨骼祖细胞成骨生成的主要能量驱动力，控制着肌肉骨骼完整性[6]。

Ecsit是控制肠道稳态和肿瘤发生的关键因素，通过调节YAP蛋白的翻译。肠道上皮是哺乳动物中最快更新的组织，其再生过程必须严格控制以最小化功能障碍和肿瘤发生的风险。YAP蛋白的有序表达和激活是驱动肠道再生和肠道稳态的关键步骤。然而，控制这一过程的调节机制仍然 largely unknown。我们发现，Ecsit在隐窝-绒毛轴上富集。肠细胞特异性消除Ecsit导致肠道分化的失调，意外地伴随着YAP蛋白的翻译增加，从而将肠道细胞转变为早期增殖干细胞样细胞并增强肠道肿瘤发生。Ecsit的缺失导致代谢重编程，有利于基于氨基酸的代谢，导致编码真核起始因子4F通路的基因的去甲基化和其表达增加，从而进一步促进YAP翻译的启动，导致肠道稳态失衡和肿瘤发生。还表明，ECSIT的表达与结直肠癌患者的生存率呈正相关。总之，这些结果表明Ecsit在调节YAP蛋白翻译以控制肠道稳态和肿瘤发生中起着重要作用[7]。

Ecsit-X4对于防止压力超负荷诱导的心脏肥大至关重要，通过调节线粒体STAT3。线粒体功能障碍是加剧压力超负荷诱导的心脏肥大和与发病率和死亡率增加相关的一个关键因素。Ecsit是炎症和线粒体功能的关键适配因子，据报道在多种物种和组织中表达多种转录本，导致具有不同亚细胞定位和功能的蛋白质亚型。然而，在心脏细胞中是否存在未知的Ecsit亚型和其在调节线粒体功能和病理性心脏肥大中的作用仍然不清楚。这项研究确定了由转录本变体Ecsit-X4编码的42-kDa Ecsit亚型，该亚型在成年心肌细胞的线粒体中高度表达，但在肥厚的人心脏样本和TAC处理的鼠心中下调。AAV9介导的Ecsit-X4基因治疗，无论是在TAC手术之前还是之后给予，都能显著减轻心脏肥大。心肌细胞特异性Ecsit缺陷加剧了TAC诱导的心脏肥大，而Ecsit-X4补偿独立地挽救了EcsitcKO小鼠中的肥厚表型。机制上，ECSIT-X4定位于线粒体，并与STAT3相互作用，导致心肌细胞线粒体中STAT3水平和丝氨酸727位点的磷酸化增加，从而促进强大的线粒体生物能量。这项研究确定了在成年心肌细胞线粒体中定位于线粒体的ECSIT的新转录本变体，并突出了其作为心脏衰竭治疗靶点的潜在价值[8]。

Ecsit在TLR4信号激活NF-κB中起着关键作用。Ecsit（Toll通路中的进化保守信号中间体）被认为是不同信号中的多功能调节因子，包括Toll样受体（TLRs）、TGF-β和BMP。在这里，我们报道了ECSIT在TLR4介导的信号中的新调节作用。通过LPS刺激，Ecsit形成了包括TAK1和TRAF6在内的高分子内源性复合物，其中Ecsit与每个蛋白质相互作用并调节TAK1活性，导致NF-κB的激活。ECSIT敲低THP-1（ECSIT(KD) THP-1）细胞在NF-κB活性、细胞因子产生和TLR4刺激诱导的NF-κB依赖性基因表达方面表现出严重受损，而通过重新引入野生型（WT）ECSIT基因，这些活性得到了显著恢复。有趣的是，缺乏与TAK1或TRAF6特定相互作用域的ECSIT突变体无法恢复这些活性。此外，在TAK1(KD)或TRAF6(KD) THP-1细胞中转导WT ECSIT后，TLR4介导的NF-κB活性和细胞因子产生没有显著变化，这强烈表明TAK1-ECSIT-TRAF6复合物在TLR4信号传导中的必要性。总之，我们的数据表明，包括TAK1和TRAF6在内的ECSIT复合物在TLR4介导的信号传导中以激活NF-κB[9]。

综上所述，Ecsit在多种生物学过程中发挥着重要作用，包括先天免疫反应、线粒体功能和多种疾病的发生和病理。Ecsit的研究为深入理解其生物学功能和疾病发生机制提供了新的思路和策略，并为疾病的治疗和预防提供了潜在的靶点和干预措施。