Capn11-flox 基因敲除小鼠

基因Capn11是一种钙依赖性半胱氨酸蛋白酶，属于calpain超家族的成员。Calpain超家族是一类相关蛋白质，其中一些已知功能为钙依赖性半胱氨酸蛋白酶。在哺乳动物中，已经鉴定出八种不同的calpain。Capn11基因位于人类染色体6上，在睾丸中具有高mRNA水平。预测的Capn11蛋白具有calpain的典型特征，包括潜在的蛋白酶和钙结合结构域。Capn11 mRNA表现出高度受限的组织分布，最高水平存在于睾丸中。辐射杂交图谱将该基因定位在人类染色体6的p12区域。系统发育分析表明，在哺乳动物中，预测的Capn11蛋白与CAPN1和CAPN2最为接近。然而，在可用的calpain序列中，预测的CAPN11序列与鸡micro/m calpain的同源性最高。因此，CAPN11可能是micro/m calpain的人类同源物。这项新calpain的发现突出了calpain家族的复杂性，其成员根据蛋白酶活性、钙依赖性和组织表达进行区分[1]。

神经性疼痛是一种直接由病变或感觉神经系统疾病引起的疼痛，与情绪调节有关。在一般人群中，神经性疼痛的发病率从7%到10%，但其潜在机制仍不完全清楚。神经性疼痛通常与多个大脑区域的结构和功能异常有关，其调节与大脑前部有关，包括伏隔核（NAc）、内侧前额叶皮层（mPFC）和导水管周围灰质（PAG）。为了研究神经性疼痛在各个大脑区域的分子机制，研究人员在神经性疼痛小鼠模型的NAc、mPFC和PAG三个大脑区域中，确定了神经性疼痛与正常小鼠之间的差异表达基因（DEGs），并将这些基因映射到一个全面的基因功能关联网络上。然后，使用随机游走重启（RWR）分析，在三个区域中确定了新的神经性疼痛基因，如Asic3、Cd200r1和MT2，以及众所周知的Capn11和CYP2E1。发现了NAc、mPFC和PAG三个大脑区域中DEGs之间的相互作用或交叉对话。这些结果为神经性疼痛提供了新的见解，并有助于探索治疗靶点[2]。

在哺乳动物中，研究最多的calpain蛋白酶家族成员是CAPN1和CAPN2，它们在脊椎动物中保守。在鸟类中，已经确定了另一种称为mu/m-CAPN的类似家族成员。研究人员建立了mu/m-CAPN与CAPN11的一对一正交关系，CAPN11之前仅在真兽类（胎盘哺乳动物）中描述过。使用CAPN11名称来指代这个家族成员，并在脊椎动物谱系中鉴定了正交物，它们形成了一个单系系统发育分支，直接祖先是CAPN1和CAPN2。在真兽类分支之前的谱系中，CAPN11编码区在强选择性净化选择下进化，非同义（d(N)）与同义（d(S)）替换率低（d(N)/d(S) = 0.076在pretherians中），其转录本在不同的组织中广泛检测到。这些特征存在于CAPN1和CAPN2的脊椎动物谱系中，表明pretherian CAPN11同样保留了广泛的生理功能。然而，在真兽类从鸭嘴兽分离的CAPN11分支上，d(N)/d(S)大约升高了7倍，伴随着向“睾丸特异性”基因调控的转变。真兽类中的d(N)/d(S)估计值大约比pretherians高3倍，编码和转录水平上的证据表明，CAPN11在有袋动物中功能缺失。许多CAPN11位点在真兽类中被功能限制以保守一个与pretherian CAPN11和CAPN1/2共享的具有截然不同生化性质的残基的固定状态。蛋白质同源建模表明，许多这样的真兽类特异性残基替换修饰或消除了与calpain抑制剂calpastatin的相互作用，这种相互作用在pretherian正交物和CAPN1/2中都被观察到。研究人员提出了一种类似于Dykhuizen-Hartl效应的模型，其中与有效种群规模减少相关的低效净化选择和增加的遗传漂变，推动了共同有袋类-真兽类祖先CAPN11的调控和编码区域的突变固定。这些变化的一小部分在真兽类祖先中具有累积适应性优势，因为精子生理学的谱系特异性方面，而在有袋动物中，没有实现优势，基因被禁用。这项工作支持在没有广泛正选择的情况下，基因家族成员正交物之间存在功能分化的可能性[3]。

为了确定非梗阻性无精症中精原细胞分化特定阶段的潜在生物标志物，研究人员进行了基因芯片人类基因1.0 ST微阵列分析，并在mRNA和蛋白质水平上进行验证。基本研究实验室。患有各种非梗阻性无精症的男性（n = 18）和具有正常精子发生的男性（n = 4）。获得31个睾丸活检样本。使用Affymetrix Human Gene 1.0 ST微阵列对根据最高倍数变化选择的14个选定基因进行基因表达分析，并通过定量聚合酶链反应和在独立微阵列样本集上验证。还进行了Western印迹和免疫组化。无精症组和对照组的基因表达谱比较分析导致选择了4,946个差异表达基因。AKAP4、UBQLN3、CAPN11、GGN、SPACA4、SPATA3和FAM71F1是在无精症患者中最显著下调的基因。全局分析还导致确定了上调基因-WBSCR28、ADCY10、TMEM225、SPATS1、FSCN3、GTSF1L和GSG1-在晚期成熟停滞的男性中。此外，定量聚合酶链反应和Western印迹的结果在很大程度上证实了微阵列数据。所选基因集可用于创建一个分子诊断工具，以确定患有特发性非梗阻性无精症的男性精子发生损害的程度[4]。

胎儿酒精谱系障碍（FASDs）与全身炎症和神经发育异常有关。已经发现几个候选基因与胎儿酒精暴露（FAE）相关行为有关，但在成年阶段尚未进行性别特异性完整的转录组分析。最近的研究表明，它们在发育阶段受到调控。然而，尚未研究RNA在FAE后代大脑发育和功能中的性别特异性作用。在这里，研究人员使用高通量转录组（RNA-seq）方法，在成年（P60）时对FAE的雄性和雌性后代的大脑皮层进行了第一次系统RNA分析。RNA-seq数据分析表明，FAE对RNA表达的影响具有明显的性别特异性。研究人员发现，基因Muc3a、Pttg1、Rec8、Clcnka、Capn11和pnp2在P60的雄性后代中的表达显著高于雌性后代。FAE雌性小鼠大脑测序数据还显示，与雄性后代相比，Eno1、Tpm3和Pcdhb2的表达增加。研究人员使用商业软件包（Ingenuity Pathway Analysis）进行了通路分析。结果表明，性别特异性顶级调节基因（Rictor、Gaba、Fmri、Mlxipl）与eIF2（翻译起始）、突触发生（神经系统中神经元之间突触的形成）、sirtuin（代谢调节）和雌激素受体（涉及肥胖、衰老和癌症）信号通路密切相关。总的来说，转录组结果显示，FAE以性别特异性的方式改变了成年大脑中的RNA表达[5]。

胃特异性calpain nCL-2和nCL-2'是钙依赖性半胱氨酸蛋白酶（calpain）超家族的成员，具有胃特异性表达。与其他典型的calpain类似，nCL-2具有三个不同的结构域，一个蛋白酶、一个C2样和一个5EF-hand Ca2+结合结构域，以及N端原肽区域。另一方面，nCL-2'缺少C2样和5EF-hand结构域，但在其他方面与nCL-2相同，除了三个C端残基。为了研究nCL-2和nCL-2'的胃特异性表达和假定替代表达机制，研究人员克隆和表征了小鼠nCL-2和nCL-2'的基因。小鼠nCL-2基因包含至少23个外显子，跨越超过50 kb，并具有一个专门用于nCL-2'的中部外显子。因此，nCL-2和nCL-2'是通过相同基因Capn8的替代剪接产生的。Capn8表现出与其他典型calpain大亚基基因CAPN1、CAPN2、CAPN3、CAPN9、CAPN11和Capn12的高度保守的基因组织，除了Capn8第9个外显子和第10个外显子之间的独特外显子，它编码nCL-2'转录本的3'一半。在CAPN1、CAPN2、CAPN3、CAPN9或CAPN11的相应区域没有发现这样的外显子。确定了小鼠nCL-2的假定人类同源物CAPN8的基因和cDNA结构，表明它在头部-头部方向上与人类CAPN2（m-calpain大亚基的基因）在1q32-41区域重叠。Capn8和CAPN8的特征说明了calpain基因进化的过程，即蛋白酶、C2样和5EF-hand结构域可能作为独立基因发挥作用，calpain超家族通过这些祖先基因单元的有序融合以及随后的扩增而进化[6]。

Calpains是一系列相关蛋白质，最初根据它们的钙依赖性和蛋白酶活性进行分类。研究人员报告了最近发现的Capn5、Capn6和Capn11基因在发育过程中的mRNA表达模式。Capn5在胚胎发生过程中的主要表达部位是发育中的胸腺、交感神经和背根神经节。Capn6 mRNA在胚胎发生期间仅在发育中的骨骼和心脏肌肉中表达，与Capn3表达区域重叠。在肺、肾脏和胎盘的特定细胞以及各种上皮细胞类型中也观察到表达，其中Capn6 mRNA似乎定位于细胞内的基底和顶端末端。Capn11 mRNA仅限于精母细胞，并且仅在减数分裂的后期阶段表达[7]。

睑痉挛（BSP）是一种局灶性肌张力障碍，其特征是眼轮匝肌的强制性眼轮匝肌痉挛，通常是双侧、同步和对称的。尽管有强烈的遗传证据表明BSP的遗传贡献，但该领域的发展受到小型队列、不完全外显率和晚发年龄的限制。尽管已经通过全外显子测序（WES）确定了与肌张力障碍相关的几种遗传病因，但其中没有一种是典型地与BSP作为单一或主要表现的关联。研究人员对来自21个独立家系的31名BSP受试者进行了WES。来自计算机分析的最强候选序列变异通过双向Sanger测序进行确认，并进行了共分离分析。在四个独立的、多代家系中，共分离了CACNA1A（NM_001127222.1: c.7261_7262delinsGT, p.Pro2421Val）、REEP4（NM_025232.3: c.109C>T, p.Arg37Trp）、TOR2A（NM_130459.3: c.568C>T, p.Arg190Cys）和ATP2A3（NM_005173.3: c.1966C>T, p.Arg656Cys）中的有害变异。在患有颅颈段肌张力障碍的父亲和儿子中，发现了HS1BP3（NM_022460.3: c.94C>A, p.Gly32Cys）和GNA14（NM_004297.3: c.989_990del, p.Thr330ArgfsTer67）中的有害变异，最初表现为BSP。在两个或更多独立的家系中发现了DNAH17、TRPV4、CAPN11、VPS13C、UNC13B、SPTBN4、MYOD1和MRPL15中的有害变异。据研究人员所知，这些基因之前没有被关联到孤立性BSP，尽管其他CACNA1A突变已经被关联到包括共济失调、周期性共济失调、偏头痛和肌张力障碍在内的正性和阴性运动障碍。WES数据集为BSP遗传学未来的研究提供了一个平台，这将需要仔细考虑不完全外显率、表型多样性、人群分层和寡基因遗传模式[8]。

典型calpain蛋白酶是calpain超家族的一个子集，调节广泛的生理过程。研究人员描述了大西洋庸鲽calpain-1、calpain-2样、“肌肉特异性”calpain-3以及最近公认的脊椎动物广泛家族成员calpain-11的完整编码正交物的特征。系统发育分析确定了每个序列在包括硬骨鱼类同源物的脊椎动物calpain的全面框架中的关系。这种方法对硬骨鱼类calpain的进化提供了重要的见解。例如，被认为是calpain-2正交物的硬骨鱼类序列形成了一个单系分支，外部于四足动物calpain-2和脊椎动物calpain-8的姐妹分支。因此，硬骨鱼类“calpain-2”可能不是直接与四足动物calpain-2正交，代表了一种calpain-2样蛋白。在每个庸鲽序列中观察到了典型calpain的特征结构域结构，尽管calpain-3像其他硬骨鱼类一样，只保留了在人类calpain-3中发现的三个进一步结构域之一（IS2）。在营养状态改变时，通过定量实时PCR测量，capn1转录水平在最大禁食时最高，然后随着再喂食而稳步下降，此时肌肉处于净正蛋白质平衡状态。相反，capn2-like几乎没有反应，而capn3和capn11转录水平在最大禁食时最低，随后在再喂食时被强烈地组成型上调。在营养状态下，庸鲽capn3转录丰度平均比capn1、capn2-like和capn11分别高6.5、23.7和5.9倍。capn1和capn11的转录水平始终高于capn2-like，但彼此之间取决于营养状态。这些基因在响应营养状态时的差异调节表明，典型calpain家族成员在调节硬骨鱼类骨骼肌中分解代谢和生长之间的平衡中具有不同的作用[9]。

抑制性KRAB结构域锌指蛋白（KRAB-ZFPs）在哺乳动物基因组中丰富，并且既有助于沉默转座元件（TEs），也有助于调节发育阶段和细胞类型特异性基因表达。在这里，研究人员描述了对锌指蛋白92（Zfp92）的研究，Zfp92是一种X连锁KRAB-ZFP，在成年小鼠的胰腺胰岛中高度表达，通过分析全球Zfp92敲除（KO）小鼠。生理学、转录组和全基因组染色质结合研究表明，ZFP92的主要功能是结合并抑制B1/Alu类型SINE元件的活动，并调节周围基因组实体的活动。Zfp92的缺失导致选择性LINE和LTR转座元件以及位于ZFP92结合染色质附近的基因的表达发生变化。Zfp92的缺失导致胰岛、脂肪组织和肌肉中特定基因的表达改变，从而导致血液葡萄糖稳态、体重和脂肪积累的适度性别特异性改变。在胰岛中，Zfp92通过转录后Mafb的影响调节出生后小鼠的血液葡萄糖浓度，而在脂肪组织和肌肉中，它通过调节Acacb来调节脂肪酸代谢的限速酶。在没有Zfp92的情况下，由于去抑制了Capn11基因内含子3中ZFP92结合SINE元件附近的IAPez TE，导致胰岛和其他几个组织中一个新的TE-Capn11融合转录本过表达。总的来说，这些研究表明，ZFP92既可抑制特定的TEs，也可调节离散组织中的特定基因的转录[10]。

综上所述，基因Capn11是一种钙依赖性半胱氨酸蛋白酶，属于calpain超家族的成员。Capn11在睾丸中具有高mRNA水平，并且在发育过程中具有性别特异性表达。研究人员已经发现Capn11在神经性疼痛、无精症和胎儿酒精暴露（FAE）后代大脑中的表达模式。此外，Capn11在硬骨鱼类中的表达模式以及其与ZFP92的相互作用也被研究。这些研究结果为Capn11在生理和病理过程中的作用提供了新的见解，并为进一步研究其在疾病中的作用提供了基础。