Homez-flox 基因敲除小鼠

Homez是一种特异性存在于脊椎动物中的homeobox基因，其编码的蛋白质具有独特的结构组织，包括三个非典型的homeodomain、两个leucine zipper-like motif和一个酸性区域。该基因在人类和小鼠组织中广泛表达，尽管在小鼠发育过程中表达模式更为受限。基因组分析表明，人类和小鼠基因分别位于14q11.2和14C，由两个外显子组成。斑马鱼和河豚的同源基因与哺乳动物序列具有高度相似性，特别是在homeodomain序列方面。基于homeodomains的同源性和蛋白质结构的相似性，Homez和ZHX家族的锌指homeodomain因子被划归为homeobox-containing蛋白质超家族的一个子集。Homez亚家族中homeodomains的类型和组成是脊椎动物特有的。系统发育分析表明，Homez谱系与相关基因在大约4亿年前分离，早于辐鳍鱼和肉鳍鱼的分离[1]。

Homez基因编码的蛋白质在神经发生中发挥重要作用。在非洲爪蟾的神经胚阶段，Homez广泛表达于神经板，在初级神经元产生的区域表达最强。在后续阶段，Homez在分化中的祖细胞中保持存在于中枢神经系统。Homez的表达受神经诱导因子、Ngnr1的阳性调节和Notch信号的阴性调节。通过注射反义morpholino寡核苷酸干扰Homez功能，导致晚期神经元标记物的表达特异性破坏，而不影响早期神经元和早期神经外胚层标记物的表达。Homez抑制实验也干扰了Ngnr1过表达动物帽外植体和Notch抑制胚胎中的晚期神经元标记物的表达。在功能获得实验中，Homez抑制了晚期神经元标记物的表达，但对早期标记物没有影响。这些数据表明，Homez在神经发生中发挥重要作用，位于proneural/neurogenic基因下游[2]。

Homez基因在雄性生育中不是必需的。Homez是一种homeodomain蛋白质，含有保守的螺旋-转角-螺旋（HTH）DNA结合基序，作为转录因子控制基因表达。先前的研究表明，Homez基因在成年睾丸中高度富集。然而，Homez在精子发生和雄性生育中的作用尚不清楚。使用CRISPR/Cas9技术产生了Homez突变小鼠，并进行了组织学、免疫荧光、定量逆转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）、Western印迹和交配实验，以分析Homez突变体的表型。分子系统发育分析表明，HOMEZ在哺乳动物物种中进化上保守。qRT-PCR和Western印迹分析显示，Homez在睾丸中高度表达，并在精子发生过程中相对增加。Homez突变雄性小鼠存活，并且与野生型相比，体重大小和睾丸重量没有差异。此外，Homez突变雄性小鼠与野生型雌性小鼠交配产生正常的幼仔数量。此外，组织病理学检测到Homez敲除雄性小鼠的曲细精管中完全的精子发生和附睾中成熟的精子。此外，与野生型睾丸相比，在Homez突变睾丸中发现了三个Zhx基因的显著增加转录。Homez敲除小鼠是可育的，对生殖细胞发育不是必需的。这些发现可以防止其他研究小组进行不必要的重复工作[3]。

Homez基因与室间隔缺损（VSD）相关。室间隔缺损是最常见的先天性心脏病（CHD）。全基因组连锁分析显示，在印度南部人群的homeodomain leucine zipper编码（HOMEZ）基因中存在一个潜在的CHD易感位点。本研究旨在在孤立性VSD的中国人群中鉴定HOMEZ的潜在致病突变，并为了解孤立性VSD的病因提供见解。在400名孤立性VSD患者和400名健康对照者中进行了病例对照突变分析。通过聚合酶链反应扩增HOMEZ基因的编码外显子和其侧翼序列，并在ABI3730自动测序仪上测序。使用CLC workbench软件比较了HOMEZ蛋白与其他多个物种的保守性。使用ExPASy-ProtScale在线工具预测了疏水性特征。在HOMEZ基因外显子-2中发现了两个新的杂合错义突变（c.116 C>T；c.630T>A）。这两个突变导致在位置39处丙氨酸变为缬氨酸，在位置210处丝氨酸变为精氨酸，这在许多物种中高度保守。位置39和210处的缬氨酸和精氨酸残基的疏水性显著不同于野生型。我们在孤立性VSD患者的中国人群中发现了HOMEZ基因外显子-2中的两个新的杂合错义突变，并发现这些突变导致HOMEZ蛋白的疏水性改变。因此，HOMEZ基因的两个错义突变与孤立性VSD的病因直接相关[4]。

Homez基因与先天性心脏病（CHD）相关。在印度南部的一个研究中，通过全基因组连锁分析，发现了一个与CHD相关的HOMEZ基因。在孟买，叔叔-侄女和第一代堂兄妹之间的婚姻很常见，为涉及近亲繁殖的CHD的连锁图谱绘制提供了一个国际研究的机遇。本研究旨在通过使用高密度寡核苷酸微阵列进行全基因组连锁分析，并招募83名出生给未受影响的近亲繁殖父母的CHD先证者，来探索CHD的隐性遗传模型。在这个涉及单核苷酸多态性（SNP）标记的连锁扫描中，基因组范围内统计显著性的阈值被设定为标准的对数优势比（LOD）分数阈值3.3，对应于1995比1的优势比。我们确定了最大的单点LOD分数为3.76（5754比1的优势比），表明CHD与HOMEZ基因上rs1055061位点的G等位基因连锁，HOMEZ是一种普遍表达的转录因子，含有leucine zipper和锌指结构。对HOMEZ外显子的重新测序没有在印度先证者中发现致病突变。此外，在美国325名CHD病例中对连锁等位基因（G）进行基因分型，与605名非CHD对照相比，没有发现基因型和等位基因频率差异。尽管近亲繁殖图谱绘制方法具有统计效力，但在一个临床异质性的印度CHD病例样本中，没有发现单一基因具有主要效应。然而，我们无法排除HOMEZ的非编码区域可能携带导致印度人群中CHD的隐性突变。需要进行进一步的研究，涉及具有特定亚型CHD的大规模多国队列的患者，以尝试复制在14号染色体上观察到的连锁峰值。此外，我们预计，在未来的CHD隐性突变检测研究中，靶向重新测序方法可以补充连锁分析[5]。

在心肌缺血再灌注损伤（I/R）的动物模型中，长非编码RNA（lncRNA）、miRNA和mRNA的表达水平被评估。通过基因本体和通路分析，然后通过构建竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络预测lncRNA-miRNA-mRNA之间的相互作用。发现与Sham组相比，I/R组小鼠心脏中有14,366个lncRNA、151个miRNA和9,377个mRNA的表达水平差异显著（折叠变化>2；P<0.05）。结果表明，这些差异表达的基因参与多个分子功能，包括“鸟苷二磷酸结合”、“RNA聚合酶II羧基末端结构域激酶活性”、“TATA结合蛋白类蛋白结合”、“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合”和“蛋白磷酸酶2A调节活性”。预测了lncRNA-miRNA-mRNA之间的相互作用，包括五个lncRNA、38个miRNA和196个mRNA，特别是Gm12040-mmu-miR-125a-5p-decapping mRNA 1B、Rpl7l1-ps1-mmu-miR-124-3p-G蛋白偶联受体146、Gm11407-mmu-miR-190a-5p-homeobox和leucine zipper编码（HOMEZ）、1600029O15Rik-mmu-miR-132-3p-HOMEZ和AK155692-mmu-miR-1224-3p-激活转录因子6β。这些发现为未来研究lncRNA、miRNA和mRNA在心肌I/R损伤中的作用提供了新的见解[6]。

miR-155在B细胞淋巴瘤的发生中发挥重要作用。miR-155在大多数B细胞淋巴瘤中高度上调，Burkitt淋巴瘤（BL）除外。然而，miR-155在B细胞淋巴瘤中的致癌机制尚不清楚。为了确定B细胞淋巴瘤中miR-155的相关靶标，我们在Hodgkin淋巴瘤（HL）细胞中抑制miR-155，并在BL细胞中过表达miR-155后，对Argonaute 2进行RNA免疫沉淀。在BL细胞中鉴定了54个miR-155特异性靶基因，并证实了miR-155对DET1、NIAM、TRIM32、HOMEZ、PSIP1和JARID2的靶向作用。其中五个靶基因也受HL细胞中内源性miR-155的调节。miR-155的过表达和miR-155新靶基因NIAM的表达抑制均增加了BL细胞的增殖。在原发B细胞淋巴瘤中，NIAM阳性病例的miR-155水平显著低于NIAM阴性病例，这表明NIAM也受miR-155在原发B细胞淋巴瘤中的调节。因此，我们的数据表明，miR-155在B细胞淋巴瘤中具有致癌作用，涉及靶向肿瘤抑制因子NIAM[7]。

ZHX蛋白具有新颖的结构特征。ZHX1至ZHX3（锌指和homeobox）形成一组同源基因，编码多结构域蛋白。ZHX蛋白由两个锌指和五个homeodomain组成。ZHX在细胞周期控制中发挥作用，作为转录调节因子核因子Y的共抑制因子。作为结构基因组学项目的一部分，我们表达了不同人类ZHX基因的单个和多个结构域片段，用于结构测定。从生物信息学协议中选择的总共30个ZHX1-3的单个和多个结构域构建体，使用高通量方法在E. coli中筛选可溶性表达。两个homeodomain被结晶，导致ZHX1 HD4和ZHX2 HD2的结构。ZHX1 HD4，尽管与“homez”和“engrailed”的homeodomains最相似，但表现出结构差异，特别是额外的C端螺旋（螺旋V），它包裹在螺旋I上，从而形成广泛的接触。尽管ZHX2 HD2-3成功表达和纯化，但在结晶过程中发生了蛋白水解，导致只有HD2的晶体。ZHX2 HD2的结构显示了一种非典型的开放构象，其中螺旋I发生“结构域交换”，形成同源二聚体。尽管通过生物信息学研究选择的ZHX1的多个结构域构建体可以可溶性表达，但只有单个homeodomain产生了晶体。ZHX1 HD4的晶体结构显示，与许多已知的homeodomains相比，通过螺旋V与螺旋I形成的广泛接触，存在额外的疏水相互作用。此外，一些带电共变残基（通常在非恒温动物中发现形成盐桥，如果蝇“engrailed”homeodomain），被非极性残基取代，进一步增加了ZHX1 HD4中的疏水接触，并可能增加了稳定性，相对于engrailed homeodomain。ZHX1 HD4的螺旋V指向通常观察到的homeodomains上的DNA大沟结合位点的相反方向，因此不会阻碍核酸的假设结合。相比之下，对于ZHX2 HD2，观察到的构象改变涉及螺旋I相对于典型homeodomain折叠的重排，破坏了正常的DNA结合位点，尽管观察到蛋白质-蛋白质结合是可能的，如在同源二聚体形成中[8]。

综上所述，Homez是一种在脊椎动物中特有的homeobox基因，编码具有独特结构的蛋白质。Homez在神经发生中发挥重要作用，并在室间隔缺损和先天性心脏病中具有潜在的影响。此外，Homez基因的表达与睾丸中的精子发生相关，但并非必需。Homez基因的突变可能导致室间隔缺损的发生。Homez基因的表达在心肌缺血再灌注损伤中发生变化，并可能与miRNA和lncRNA的相互作用有关。miR-155可能通过靶向HOMEZ基因的肿瘤抑制因子NIAM在B细胞淋巴瘤中发挥致癌作用。ZHX蛋白具有新颖的结构特征，可能影响蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质的相互作用。Homez基因的研究有助于深入理解其在神经发生、心脏发育和疾病发生中的作用机制，为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。