Rsf1-flox 基因敲除小鼠

RSF1，也称为重塑和间隔因子1，是一种重要的细胞间期着丝粒蛋白，在多种类型的癌症中过度表达，并与不良的整体生存率相关。RSF1的主要功能包括维持染色体稳定性、促进DNA修复、维持RSF1蛋白的蛋白稳态以及抑制一些致癌基因的转录，当RSF1蛋白表达在最佳水平时。然而，RSF1的过度表达会促进药物耐药性和细胞周期检查点抑制，从而促进癌症增殖和生存。RSF1的表达水平和基因背景对其功能至关重要，这可以解释为什么RSF1在不同的癌症类型中具有不同的功能。一项综述总结了RSF1的功能域、基于TCGA和GTEX数据库的RSF1和SNF2H在癌症中的过度表达状态、RSF1与H2Aub、HDAC1、CENP-A、PLK1、ATM、CENP-S、SNF2H、HBX、BubR1、细胞周期蛋白E1、CBP和NF-κB相互作用的癌症相关功能以及RSF1的潜在临床价值，这将为进一步研究RSF1的结构生物学和应用RSF1抑制剂、截短的RSF1蛋白和SNF2H抑制剂治疗RSF1过度表达的肿瘤奠定理论基础[1]。

RSF1基因的过度表达或扩增与多种人类癌症的预后不良相关，包括卵巢癌。在之前的研究中，RSF1被确定为一种扩增基因，它促进了紫杉醇耐药性卵巢癌的发展。在目前的研究中，进一步证明了RSF1的表达与卵巢癌患者对紫杉醇的反应呈负相关，并且在卵巢癌小鼠异种移植模型中也得到了证实。此外，在紫杉醇耐药性卵巢癌细胞系中，过表达RSF1被发现表达升高的NF-κB调节基因，包括一些与逃避凋亡（CFLAR、XIAP、BCL2和BCL2L1）和炎症（PTGS2）相关的基因。此外，使用Tet-off诱导的SKOV3细胞过表达RSF1显著增强了NF-κB依赖性基因表达和NF-κB的转录激活。使用短发夹RNA敲低RSF1抑制了这些相同的途径。此外，使用NF-κB抑制剂预处理或下调NF-κB调节基因表达显著增强了RSF1过表达的OVCAR3和/或RSF1诱导的SKOV3细胞对紫杉醇的敏感性。免疫共沉淀实验表明，RSF1与NF-κB和CREB结合蛋白相互作用，后者是NF-κB的广泛共激活因子。染色质免疫沉淀实验证明了RSF1被募集到PTGS2和XIAP启动子中的NF-κB结合元件。此外，hSNF2H，RSF1的一个已知结合伙伴，部分参与了RSF1和NF-κB之间的相互作用。总的来说，这些数据表明RSF1可能作为NF-κB的共激活因子，从而增强卵巢癌细胞中化学耐药性发展所必需的基因的表达[2]。

RSF1基因在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的细胞分裂周期中的隔膜形成中发挥调节作用。隔膜形成是通过在出芽形成时沉积的几丁质环转化为初级隔膜来进行的。研究发现，在某些条件下，这种隔膜形成依赖于新发现的RSF1基因。然而，携带rsf1-1突变的细胞在细胞分裂后期积累，初级隔膜的转化延迟。这种由rsf1-1介导的隔膜形成抑制仅在生物合成应激条件下发生，并且与生物合成介导的细胞周期调节步骤START的抑制相关。RSF1基因与负责隔膜形成的CHS2几丁质合成酶基因不同，因此RSF1最可能编码一个几丁质合成的调节因子。研究者假设RSF1活性在生物合成应激期间促进隔膜形成，以便在这些条件下实现高效的隔膜形成[3]。

RSF1（重塑和间隔因子1）是RSF复合物的一个亚基，被鉴定为H2Aub结合蛋白，介导这种组蛋白修饰的基因沉默功能。RSF1通过一个以前未表征的、称为泛素化H2A结合域的必需区域与H2Aub，而不是H2Bub核小体，特异性结合。在人类和鼠细胞中，由RSF1调节的基因与由PRC1（多梳抑制复合物1）的亚基RNF2/Ring1B调节的基因显著重叠，RNF2/Ring1B催化H2AK119的泛素化。大约82%的H2Aub富集基因，包括经典的PRC1靶基因Hox基因，在其转录起始位点周围被RSF1结合。通过Ring1B敲除降低H2Aub水平导致RSF1结合显著减少。相反，RSF1敲除不影响RNF2/Ring1B或H2Aub水平，但导致H2Aub靶基因的去抑制，伴随着H2Aub染色质组织和连接组蛋白H1的释放。RSF1在H2Aub介导的基因沉默中的作用通过基于染色质的体外转录进一步证明。最后，RSF1和Ring1在非洲爪蟾早期胚胎发育的间充质细胞分化和原肠胚形成中协同作用。总的来说，这些数据确定了RSF1是一个H2Aub读取器，它通过在启动子区域维持稳定的核小体模式来促进H2Aub介导的基因沉默[4]。

在MA.12随机临床试验中，与CCND1（细胞周期蛋白D1）基因扩增相比，RSF1基因扩增可能预测高风险绝经前乳腺癌患者接受辅助他莫昔芬治疗无效。大多数雌激素受体表达的乳腺癌患者在接受抗雌激素药物如他莫昔芬时可能不需要或从中受益。除了雌激素受体，没有预测生物标志物可以帮助选择乳腺癌患者进行他莫昔芬治疗。CCND1基因扩增是一个假定的他莫昔芬预测生物标志物。RSF1（重塑和间隔因子1）基因经常与CCND1在染色体11q上共扩增。研究者验证了这些生物标志物在MA.12随机研究中预测价值，该研究比较了高风险绝经前早期乳腺癌的辅助他莫昔芬与安慰剂。绝经前女性患有阳性淋巴结/高风险阴性淋巴结早期乳腺癌接受标准辅助化疗，然后随机接受他莫昔芬（20 mg/天）或安慰剂5年。评估总生存期（OS）和无病生存期（RFS）。对495个乳腺癌肿瘤（占患者的74%）的组织芯片进行荧光原位杂交，以测量CCND1和RSF1的拷贝数。使用多变量Cox模型获得危险比（HR），调整临床病理因素，以评估这些生物标志物对OS和RFS的影响。672名女性被随访了中位数为8.4年。研究者能够测量442名患者的CCND1 DNA拷贝数和413名患者的RSF1 DNA拷贝数。在这些患者中，8.7%的患者观察到CCND1基因扩增，6.8%的患者观察到RSF1基因扩增，主要在雌激素受体阳性乳腺癌中。尽管对于CCND1或RSF1扩增，没有观察到与治疗相关的统计学显著相互作用，但RSF1拷贝数高的患者并没有从他莫昔芬中获益（HR = 1.11，相互作用p = 0.09）。与CCND1扩增不同，RSF1扩增可能预测高风险绝经前乳腺癌患者接受辅助他莫昔芬治疗的预后[5]。

通过使用基于高密度DNA芯片和变性高效液相色谱（DHPLC）的图谱策略，研究者克隆了拟南芥RSF1基因。通过染色体步移对基因进行图谱绘制是一种广泛使用的技术，适用于通过诱变法可识别的任何基因的克隆。研究者使用经典的遗传分析和两种新开发的技术：高密度寡核苷酸DNA芯片分型和变性DHPLC，分离了导致拟南芥哥伦比亚品系隐性突变rsf1（对远红光的敏感性降低）的基因。拟南芥AT412基因分型芯片和32个F2植物被用来将rsf1突变定位到染色体1的顶部附近，大约500 kb的区间。使用DHPLC，研究者发现并分型了额外的标记用于精细图谱绘制，将区间缩短到大约50 kb。突变基因通过DHPLC直接鉴定，通过与rsf1突变株和亲本菌株哥伦比亚分别产生的扩增子进行比较。DHPLC分析在两个重叠的多态性扩增子中产生多态性谱图，这些扩增子归因于一个编码292个氨基酸蛋白的基因中的第3个外显子的13 bp缺失，该蛋白具有碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）结构域。rsf1中的突变导致了一个截短蛋白，由前129个氨基酸组成，但缺乏bHLH结构域。克隆RSF1基因强烈表明，许多光敏色素A介导的反应需要一个bHLH类转录因子[6]。

重塑和间隔因子1（RSF1），是染色质重塑因子之一，与DNA损伤反应（DDR）和DNA修复有关。然而，RSF1在DDR中的生物学后果及其分子机制在体内仍然未知。由于DDR缺陷与神经病理学表型相关，研究者开发了神经特异性Rsf1敲除小鼠。Rsf1缺失并没有导致任何神经病理学异常，但阻止了神经发生过程中过度DNA链断裂触发的神经凋亡。同样，在DNA损伤后，RSF1缺陷的人类细胞系中，细胞死亡显著减少，这些细胞的全球转录组显示，在DNA链断裂后，p53下游基因的表达显著减少。这些基因的失活是由于p53/p300复合物结合的减少和其启动子区域H3乙酰化的减少。研究者的数据表明，RSF1对于p53依赖性基因表达在DNA链断裂后的凋亡中是必需的，通过控制p53/p300复合物与其靶基因的易接近性，有助于维持细胞完整性[7]。

染色质重塑因子RSF1在有丝分裂着丝粒中富集，对于适当的染色体排列和分离至关重要，其潜在的机制仍有待揭示。研究者表明，RSF1通过在其活化环中的Thr236上创建一个激活磷酸化来招募PLK1到着丝粒，这对于Aurora B的活化是必不可少的。在结构建模中，磷酸化的Thr236增强了附近Asp200的碱催化，促进了Thr232的自磷酸化。相应地，RSF1-PLK1是Aurora B介导的错误校正中的微管去稳定性的中心。然而，在完整的微管-动粒附着下，RSF1-PLK1定位于动粒，无论张力如何，都会阻止Aurora B的激活并磷酸化BubR1。RSF1-PLK1到动粒的空间移动是由Aurora B介导的着丝粒组蛋白H3上Ser28的磷酸化触发的。研究者提出了一个调节RSF1-PLK1轴，该轴在空间和时间上控制Aurora B的开关。RSF1-PLK1-Aurora B之间的这种反馈回路可能在早期有丝分裂时协调动态微管-动粒附着的开/关切换，此时完整的张力尚未产生[8]。

多梳组（PcG）蛋白是基因表达和发育程序的关键调节因子，通过组蛋白的共价修饰来实现。然而，那些解释组蛋白修饰标记以调节胚胎发生的因素研究较少。研究者之前确定了重塑和间隔因子1（RSF1）为组蛋白H2A赖氨酸119泛素化（H2AK119ub）的读取器，这是一种由多梳抑制复合物1（PRC1）沉积的组蛋白标记。在目前的研究中，研究者使用非洲爪蟾Xenopus laevis作为模型来研究RSF1如何影响早期胚胎发育，以及识别H2AK119ub是否对RSF1的功能很重要。研究者表明，敲低非洲爪蟾RSF1，rsf1，不仅如前所述导致原肠胚形成缺陷，而且在神经前体细胞中的特定靶向敲低导致神经和神经嵴缺陷，标记基因减少。与在非洲爪蟾中敲低PRC1成分相似，rsf1敲低胚胎的前后神经模式受到影响。H2AK119ub的结合似乎对rsf1的功能至关重要，因为删除了UAB结构域的构建体，该结构域对于RSF1识别H2AK119ub核小体是必需的，未能挽救rsf1形态发生胚胎，并且在异位表达时对干扰早期非洲爪蟾发育的作用较小。此外，使用ring1a-smad2融合蛋白在Smad2靶基因gsc上异位沉积H2AK119ub导致RSF1的异位募集。当在腹侧组织中表达时，融合蛋白在动物区域诱导间充质标记或在二次轴诱导中效率较低。总的来说，研究者的结果表明，rsf1在早期非洲爪蟾胚胎中调节与PRC1成分相似的发育过程，并且RSF1至少部分通过UAB结构域与H2AK119ub标记结合在发育过程中发挥作用[9]。

PLK1在有丝分裂动粒的积累和功能对于染色体排列和分离至关重要；然而，PLK1募集到动粒的机制仍然不清楚。染色质重塑因子RSF1紧密地与着丝粒蛋白相关联，但其有丝分裂功能尚不清楚。研究者表明，RSF1定位于有丝分裂动粒，并且直接结合PLK1。RSF1的缺失会破坏PLK1在动粒上的定位；RSF1的C端片段，可以结合PLK1，足以恢复PLK1的定位。此外，CDK1在Ser1375处磷酸化RSF1，这对于PLK1的募集是必要的。随后，PLK1在Ser1359处磷酸化RSF1，稳定PLK1的沉积。重要的是，RSF1的缺失模拟了由PLK1敲低引起的染色体错排表型；这些缺陷可以通过RSF1 S1375D或RSF1 S1359D挽救，但不能通过RSF1 S1375A挽救，这表明RSF1的磷酸化与染色体排列之间存在功能性联系。总的来说，这些数据表明RSF1是一个必需的着丝粒成分，它将PLK1募集到动粒，并在忠实的细胞分裂中发挥重要作用[10]。

综上所述，RSF1是一种在维持染色体稳定性、促进DNA修复和细胞周期调控中发挥重要作用的蛋白质。RSF1的过度表达与多种癌症的发生和发展相关，它通过调节基因表达和信号通路，影响细胞的增殖、分化和凋亡。RSF1在癌症中的作用是一个复杂的调控网络，涉及多个蛋白质的相互作用和信号传导途径。此外，RSF1还在胚胎发育和细胞分裂中发挥重要作用，它通过调控染色质结构和基因表达，影响细胞的命运决定和器官形成。因此，RSF1是一个多功能的蛋白质，在多种生物学过程中发挥着重要作用。