Lim2-flox 基因敲除小鼠

Lim2基因，也称为MP19基因，编码眼晶体特有的内在膜蛋白MP19。MP19在眼晶体纤维细胞的结构或通讯中发挥着关键作用，因此可能与白内障形成有关。Lim2基因在129/SvJ小鼠基因组DNA库中被分离和表征，发现其与邻近基因Nkg7相邻，后者编码17 kDa的粒细胞膜蛋白GMP-17。这两种蛋白质在许多方面都非常相似，都为跨膜蛋白，每个蛋白质都有4个跨膜环。小鼠Lim2基因的编码核苷酸序列与人LIM2基因的编码核苷酸序列有88%的相同性，在氨基酸水平上有92%的相同性。在两种基因的5'-上游区域，观察到几个高度保守的区域。由于MP19和GMP-17蛋白质的相似性，有趣的是推测眼晶体MP19和淋巴细胞相关的GMP-17可能起源于一个原始基因，通过基因漂变，导致了两种在两种截然不同的组织类型中具有相似功能的分离蛋白质[2]。

Lim2基因在To3小鼠突变中发生了突变，To3小鼠是一种白内障突变小鼠。在To3小鼠的Lim2基因中，第一编码外显子内发现了一个G -> T颠换，导致MP19多肽的15位氨基酸由缬氨酸取代了正常的甘氨酸。这个基因突变确认了Lim2是To3白内障的理想候选基因。未来的转基因实验应该提供证据或反驳已确定的突变与白内障表型之间的因果关系。这些研究表明，MP19可能在正常的眼晶体发育和白内障形成中都发挥着重要作用，并值得对其进行更深入的探讨[3]。

在四个中国家庭中，先天性白内障与LIM2基因中的Arg130Cys突变有关。所有患者均接受了全面的眼部检查，主要发现包括先天性白内障、眼轴长度延长和与近视相关的眼底变化。LIM2基因突变，p.Arg130Cys，在所有患者中被检测到。这种变异已被其他研究者在之前报道过，并与孤立性白内障相关。这是第一项报告LIM2基因中的p.Arg130Cys突变与多种眼部表型相关的研究，这表明该基因的表型异质性。LIM2可能不仅作为眼晶体纤维细胞中的内在膜蛋白发挥作用，还可能与眼球轴的发育相关[1]。

在一个近亲结婚的家庭中，非综合征性常染色体隐性先天性白内障（arCC）的分子基础是LIM2基因中的突变。所有参与研究的家庭成员都接受了全面的眼部检查，以确定他们的眼部表型和提供血液样本，从中提取基因组DNA。对LIM2（眼晶体内在膜蛋白2）基因进行了双向测序，以确定导致疾病的突变。使用同源建模、突变和生物信息学算法以及进化保守数据库，在硅中进行突变引起的物理变化分析。通过在活鼠模型中实时表达分析Lim2，评估LIM2对眼部发育的生理重要性。眼科检查证实了家族中受影响成员的核性白内障的诊断；遗传模式和婴儿早期白内障的发展表明了arCC。全基因组连锁分析将关键区域定位到19号染色体上，两点对数优势比（LOD）得分为3.25。双向测序在LIM2中鉴定出一个新的错义突变，c.233G>A（p.G78D）。这种突变与疾病表型相关，并且在192个种族匹配的对照染色体中未发现。硅分析预测突变体LIM2编码的蛋白质（MP19）与野生型相比，疏水性、疏水性和极性较低。此外，这些分析预测突变会破坏MP19跨膜区域的二级结构。Lim2的表达在活鼠的眼晶体中早在胚胎第15天（E15）就被检测到，并在出生后增加到一个水平，并在产后时间点持续维持。LIM2中的一个新错义突变是常染色体隐性先天性白内障的原因[4]。

在缺乏眼晶体内在膜蛋白-2（Lim2）基因的小鼠中，对眼晶体的光学特性进行了表征，该基因编码眼晶体纤维细胞质膜的第二丰富整合蛋白（Lim2）。从基因敲除胚胎干细胞库中衍生出Lim2缺陷小鼠。通过聚合酶链反应（PCR）扩增尾部基因组DNA和重新测序进行基因分型。通过反转录（RT）PCR和眼晶体总RNA的Northern印迹、眼晶体膜提取物中的免疫印迹以及眼晶体切片的免疫荧光共聚焦显微镜分析Lim2表达。通过光学显微镜评估眼晶体形态，并通过激光成像系统量化眼晶体的屈光特性。基因组PCR扩增和重新测序表明，基因敲除载体破坏了Lim2的第3个内含子，有效导致了空等位基因（Lim2(Gt)），经RT-PCR扩增和测序、RNA印迹、免疫印迹和免疫荧光共聚焦显微镜验证。杂合子Lim2基因敲除眼晶体（Lim2(Gt/+))在形态上与野生型无法区分，而纯合子Lim2基因敲除眼晶体（Lim2(Gt/Gt)）始终在眼晶体核中发展出微弱的、中心的粉末状白内障。激光成像分析表明，通过Lim2(Gt/Gt)眼晶体周边皮层的射线比正常时更强烈地折射，这表明眼晶体的内部梯度折射率被破坏。这些数据表明，杂合子Lim2的丢失不足以在鼠中触发白内障，它们提供了第一个直接证据，即Lim2在建立眼晶体的正确内部屈光特性中发挥着关键作用[5]。

在一个近亲结婚的伊拉克犹太家庭中，我们研究了三个患有早发性白内障的兄弟姐妹，这种白内障首先在20岁到51岁之间被注意到，并且以常染色体隐性模式分离。使用与25个先前与人类和鼠类先天性白内障相关的基因和位点密切相关的微卫星重复标记，我们确定了19号染色体上的五个标记，这些标记与疾病相关。LIM2是这一区域中两个候选基因之一，其测序揭示了蛋白质105位点的苯丙氨酸到缬氨酸的替换，这是由T->G改变引起的。据我们所知，这是人类中与LIM2突变相关的白内障形成的第一个报道。对晚发性单基因白内障的研究可能为更常见的年龄相关性白内障的发病机制提供见解[6]。

先天性白内障是罕见的，在发达国家，每100,000个出生中有30个病例，另有10个病例在儿童时期被诊断出来。它们主要反映了由基因引起的眼晶体及其周围眼部组织的发育性改变。即使现代人类遗传学在人类遗传性疾病特征的表征方面取得了很大的进展，但基本发育过程只能在模型生物体中进行研究。小鼠是一个很好的模型，因为它与人类（作为哺乳动物）相似，并且具有遗传特征。这篇综述将我们对先天性、人类白内障的遗传和发育知识与其相应的鼠类模型结合起来。首先，早期事件将受到编码转录因子的基因的影响，如Pax6、Pitx3、Maf或Sox。如果眼晶体正在成熟，则会影响眼晶体膜（水通道蛋白/Mip、Lim-2或连接蛋白）或眼晶体纤维细胞细胞质的结构蛋白（晶体蛋白）的突变变得更加重要。从遗传学的角度来看，白内障引起的突变并非随机分布。最近几年，发现了大量对眼和眼晶体发育重要的基因，取得了很大进展。然而，仍然存在许多有待在鼠类和人类中进行表征和功能研究的突变，这表明临床医生简单地称为“白内障”的疾病在遗传上具有广泛的异质性[7]。

在一个四代中国家庭中，先天性膜性白内障与LIM2基因的一个新突变有关。对13名受先天性膜性白内障影响的四代家系成员进行了全外显子分析；通过Sanger测序验证了已确定的变异的共分离分析。所有成员都接受了详细的物理检查和完整的眼睛检查。通过同源建模，在硅中分析了突变引起的物理变化。在扫描电子显微镜下观察了来自该家族一名白内障患者的眼晶体纤维块。从该家族一名白内障患者捐赠的人眼晶体中提取了细胞膜蛋白和细胞质蛋白，以及来自一名与该家族无关的患者的穿透性眼外伤引起的脱位眼晶体，通过Western印迹（WB）检测这些蛋白中MP20和Cx46的表达和定位。在常染色体显性（AD）模式中鉴定了一个新的LIM2杂合子突变（c.388C>T，p.R130C），与先天性膜性白内障相关。该家族的所有患者都观察到眼球震颤和弱视，大多数患者观察到外斜视和长眼轴。A/B超声扫描和超声生物显微镜检查发现所有白内障眼的眼晶体中央厚度在1.7到2.7毫米之间明显变薄。生物信息学分析表明，突变对LIM2编码的MP20的生理功能有害。此外，通过扫描电子显微镜，白内障核的超微结构显示，眼晶体纤维细胞（LFCs）保留了未成熟纤维细胞的形态学特征，包括带有直边的细胞表面和缺乏正常的球窝关节边界，这表明LFCs的分化可能受到抑制。在人白内障眼晶体中，LFCs的细胞质中观察到MP20和Cx46的积累。我们鉴定了一个新的杂合子LIM2（c.388C>T，p.R130C）突变，以AD模式遗传。这种LIM2突变导致MP20和Cx46在LFCs中的异常亚定位，从而导致膜性白内障[8]。

在一个突变筛选中，我们确定了新的小鼠突变体Aca47，其具有小的眼晶体和减少的眼轴长度。这项研究的目的是对小鼠突变体Aca47进行分子和形态学特征分析。通过非侵入性活体激光干涉生物测量分析眼大小参数，分析了父系N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）处理的C57BL/6J小鼠的后代。使用单核苷酸多态性和微卫星标记对眼大小突变体Aca47进行连锁分析。通过序列分析定位候选基因，鉴定了Aca47突变。通过限制分析排除了突变位点的普遍多态性。通过组织学对Aca47小鼠突变体的眼睛进行了表征。在虚拟鼓中检查视觉特性。我们鉴定了一个新的突变体，其特征是眼晶体显著较小，眼轴长度减少，而没有角膜厚度、前房深度或房水大小的变化。眼晶体的较小尺寸在纯合子突变体中更为明显，纯合子突变体进一步在眼晶体核中发展出先天性白内障。将突变定位到7号染色体上，位于D7Mit247和D7Mit81标记之间。使用定位候选方法，对编码眼晶体内在整合膜蛋白MP19的基因Lim2进行了测序；在cDNA位置151处发生T→C交换，导致Lim2蛋白位置51处的半胱氨酸到精氨酸的替换。成年杂合子突变体的眼组织学没有显示出细胞水平的改变。然而，纯合子眼晶体在皮层中显示出排列不规则的眼晶体纤维层。虚拟视觉测试表明，杂合子的眼尺寸减少不会影响视觉特性。这些发现表明，Lim2基因中存在一个新的错义突变，以半显性方式影响眼晶体的发育。由于纯合子突变体发展出眼晶体核白内障，因此这条线可以作为人类遗传性白内障形成的模型[9]。

综上所述，Lim2基因编码眼晶体特有的内在膜蛋白MP19，在眼晶体纤维细胞的结构或通讯中发挥着关键作用，因此可能与白内障形成有关。研究表明，LIM2基因的突变与多种白内障表型相关，包括先天性白内障、早发性白内障和膜性白内障。这些研究为理解LIM2基因在眼晶体发育和白内障形成中的作用提供了重要信息，并为白内障的预防和治疗提供了新的思路和策略。