Trpm6-flox 基因敲除小鼠

Trpm6，也称为Transient Receptor Potential Melastatin 6，是一种双功能蛋白，由一个TRP阳离子通道片段和一个α型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶共价连接而成。该基因在肠道和肾脏上皮细胞中表达。在人类中，Trpm6基因的失功能性突变会导致低镁血症伴随继发性低钙血症（HSH），表明Trpm6通道激酶在全身镁离子（Mg2+）稳态中发挥着核心作用。相比之下，Trpm6基因敲除小鼠表现出胎儿发育延迟、神经管缺陷和胎儿死亡。此外，Trpm6在胎儿和成体生物中的可能功能将在本章中讨论[1]。

Trpm6是TRP通道家族的一员，该家族包含哺乳动物中的八个成员（TRPM1-TRPM8）。TRP通道是一类高度渗透二价阳离子的离子通道，如钙（Ca2+）、镁（Mg2+）和锌（Zn2+）（TRPM1、TRPM3、TRPM6和TRPM7），非选择性阳离子通道（TRPM2和TRPM8）和单价阳离子选择性通道（TRPM4和TRPM5）。TRPM通道家族中的三个成员含有酶蛋白结构域：TRPM6和TRPM7融合到α-激酶结构域，而TRPM2与ADP-核糖结合的NUDT9同源结构域相连。TRPM通道也作为细胞传感器在许多生理过程中发挥作用，包括矿物质稳态、血压、心律和免疫力，以及光感受、味觉感受和热感受。TRPM通道在肾脏中大量表达。TRPM基因的突变导致几种遗传性人类疾病，而在人类疾病动物模型中的临床前研究表明TRPM通道是很有前景的新治疗靶点[2]。

在胃肠道癌症中，离子通道的功能影响多种细胞过程，其中许多与癌症的标志性过程重叠。在本综述中，我们重点讨论了钙（Ca2+）、钠（Na+）、钾（K+）、氯（Cl-）和锌（Zn2+）转运蛋白在胃肠道癌症中的作用，特别强调KCNQ1 K+通道和CFTR Cl-通道在结直肠癌（CRC）中的作用。钙是普遍存在的第二信使，作为多种细胞过程的信号分子，如控制细胞周期、凋亡和迁移。TRP超家族的各种成员，包括TRPM8、TRPM7、TRPM6和TRPM2，已被证明与胃肠道癌症有关，尤其是在胰腺腺癌中过度表达和在结肠癌中的下调。电压门控钠通道（VGSCs）传统上与神经元和肌肉细胞等电兴奋细胞的动作电位的启动和传导有关。VGSC NaV1.5在人类结直肠癌细胞系中丰富表达，在原发CRC样本中高度表达。研究表明，NaV1.5通道的传导对CRC细胞的侵袭性和癌症进展有显著的贡献。ZIP/SLC39A和ZnT/SLC30A家族的Zn2+转运蛋白在所有主要的胃肠道器官癌症中表达失调，尤其是在胰腺癌（PC）中的ZIP4上调。在胃肠道中，有超过70个K+通道基因，分为四个家族，它们调节一系列细胞过程，包括胃中的胃泌素分泌和肠道中的阴离子分泌和液体平衡。在胃肠道中发现几种不同类型的K+通道失调。值得注意的是，hERG1在PC、胃癌（GC）和CRC中上调，导致癌症血管生成和侵袭增强，而CRC中KCNQ1下调，KCNQ1表达与II、III和IV期疾病的无病生存率提高相关。Cl-通道在胃肠道中的各种细胞和组织过程中至关重要，特别是在结肠中的液体平衡。最值得注意的是CFTR，其缺乏导致肠道中的粘液堵塞、微生物失调和炎症。CFTR是几种胃肠道癌症的肿瘤抑制因子。囊性纤维化患者患CRC的风险显著增加，而CFTR表达水平低与散发性CRC的整体无病生存率差相关。在胃肠道癌症中失调的另外两类氯通道是氯细胞内通道（CLIC1、3 & 4）和氯通道辅助蛋白（CLCA1、2、4）。CLIC1 & 4在PC、GC、胆囊癌和CRC中上调，而CLCA蛋白在CRC中已被报道下调。总之，从离子通道的多种影响来看，它们的异常表达和/或活性可以促进恶性转化和肿瘤进展。此外，由于离子通道通常定位于质膜，并受多层调节，因此它们代表有希望的 临床治疗靶点，包括当前药物的重利用[3]。

TRPM6和TRPM7通道激酶具有独特的双功能结构，它们结合了离子转运结构域和具有酶活性的激酶结构域。TRPM7在迄今为止调查的每种哺乳动物组织中都有发现。这种一体化的蛋白质结构、广泛的表达谱以及蛋白质独特的生物物理特性，使TRPM7参与了众多（病理）生理过程。由于其在全球和系统性镁稳态中的突出作用，TRPM7成为胚胎发育、全身缺血、心血管疾病和癌症中的关键参与者[4]。

为了探索一个受低镁血症继发性低钙血症影响的家族的分子发病机制，研究人员使用Sanger测序检测了患者及其父母TRPM6基因的潜在变异。结果表明，患者携带了TRPM6基因的新的纯合子c.3311C>T（p.Pro1104Leu）变异，其父母均为杂合子携带者。使用软件分析蛋白质功能预测该变异具有高风险的致病性。TRPM6基因的纯合子c.3311C>T（p.Pro1104Leu）变异可能是导致该患者疾病的原因[5]。

TRPM6和TRPM7是作为第一个拥有自己激酶结构域的离子通道而引起关注的。很快，这两种蛋白质就被迅速地与镁稳态的调节联系起来。然而，对小鼠和斑马鱼中这些通道激酶的生理功能的研究揭示了它们在骨骼生成和黑色素细胞形成、胸腺生成、细胞粘附以及早期发育中的神经褶闭合等方面的作用。此外，TRPM6基因的突变构成了低镁血症继发性低钙血症这种罕见的常染色体隐性疾病的根本遗传缺陷，该疾病的特点是血清镁低，伴有低钙血症。另一方面，在大脑中耗尽TRPM7的表达被证明可以显著减轻伴随缺血期间缺氧-葡萄糖剥夺的细胞破坏。本综述的目的是总结来自分子遗传学、生化、电生理学和药理学研究的这些独特的通道激酶的数据[6]。

哺乳动物瞬时受体电位melastatin（TRPM）通道是一种形式的钙通道，它们转运钙和镁离子。TRPM有八个亚类，包括TRPM1-8。TRPM2、TRPM6、TRPM7、TRPM8特别在肝细胞中表达。因此，我们的目标是研究在肝缺血再灌注大鼠模型中，使用维拉帕米处理后，TRPM2、TRPM6、TRPM7和TRPM8基因表达的影响以及组织病理学变化。动物被随机分配到以下组之一，包括假手术（n=8）组、维拉帕米（钙进入阻滞剂）（n=8）组、缺血再灌注（I/R）组（n=8）和I/R-维拉帕米（n=8）组。通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）评估TRPM 2、6、7、8基因的表达水平，并通过苏木精和伊红（HE）检查确定组织病理学变化。与假手术组相比，缺血再灌注（I/R）、维拉帕米、I/R-维拉帕米组的TRPM 2、6、7和8基因的表达水平显著升高。TRPM 2、6、7和8的p值分别为0.0024、< 0.0001、0.0002和0.006。在I/R组中，观察到来自肝细胞的严重坏死、退行性变和严重出血区域。此外，在I/R-维拉帕米组中，观察到来自肝细胞的轻度坏死、退行性变和轻度出血区域。这是第一个报道在肝缺血再灌注大鼠模型中TRPM 2、6、7、8表达水平之间关联的研究。此外，TRPM 2、6、7、8影响肝缺血再灌注[7]。

血液镁（Mg）水平的严格控制对于众多生理过程至关重要。持续性低镁状态（低镁血症）与严重的健康风险相关，并参与2型糖尿病、骨质疏松症、哮喘以及心脏和血管疾病的发生。由于鉴定了与低镁血症疾病相关的新的基因和调节途径，目前的观点已经大大扩展。本综述旨在提供有关瞬时受体电位melastatin 6（TRPM6）调节及其在维持镁稳态中作用的最新概述。上皮细胞镁通道TRPM6被认为是肾脏远端曲小管中Mg2+的进入途径，在这里它作为控制身体Mg2+平衡的守门人。各种因素和激素不仅对TRPM6的功能，而且对其失调都有贡献，这对肾脏Mg2+处理有重大影响。最近的遗传和分子研究进一步阐明了上皮细胞Mg2+转运的信号传导过程，包括它们对TRPM6表达和功能的影响。了解TRPM6的功能对于解开其在Mg2+处理中的作用至关重要，并将特别提供一个分子基础，以更好地理解Mg2+的吸收不良和全身Mg2+平衡[8]。

我们的对肾脏镁（Mg2+）处理分子机制的理解近年来有了很大的提高。本综述强调了通过其影响上皮细胞Mg2+通道TRPM6（瞬时受体电位Melastatin亚型6），即身体Mg2+平衡守门人的调节因子。药物治疗、酸碱状态和几种激素已被证明可以调节TRPM6的表达，而其通道活性则由细胞内Mg2+、pH和ATP修饰。最近，表皮生长因子（EGF）和雌激素已被认为是镁营养素激素。EGFR的刺激导致涉及Rac1的细胞内级联反应，促进TRPM6转运到质膜。此外，长期EGF治疗上调TRPM6的表达。雌激素还被证明可以刺激TRPM6的活性，除了其对TRPM6转录的长期调节作用外。TRPM6及其最接近的同系物TRPM7由一个Mg2+渗透通道融合到一个α-激酶结构域。在细胞质中，激活的C激酶受体（RACK1）、雌激素受体活性抑制因子（REA）和ATP被确定为通过其α-激酶结构域负调节TRPM6活性的负调节因子。因此，α-激酶结构域作为间接参与者，通过其在TRPM6介导的Mg2+流入中的反馈功能参与Mg2+稳态[9]。

TRPM6和TRPM7是melastatin相关的瞬时受体电位（TRPM）亚家族的离子通道成员。在小鼠中删除任何一个基因都是胚胎致命的。TRPM6/7是已知唯一同时具有离子通道孔和丝氨酸/苏氨酸激酶（chanzyme）的单个多肽的例子。这里我们表明，TRPM6的C端激酶结构域以细胞类型特异的方式从通道结构域中裂解，并且是活性的。裂解需要通道电导是功能的。裂解的激酶转移到细胞核，在那里严格定位并磷酸化特定的组蛋白丝氨酸和苏氨酸（S/T）残基。TRPM6裂解的激酶（M6CKs）结合蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）分子复合物的亚基，该复合物通过甲基化组蛋白精氨酸残基进行重要的表观遗传修饰。M6CK介导的组蛋白磷酸化导致相邻精氨酸的甲基化显著减少。敲除TRPM6或其激酶的失活导致组蛋白S/T磷酸化发生全球性变化，并改变数百个基因的转录。我们假设M6CK与PRMT5分子复合物在细胞核中结合，引导M6CK到一个特定的基因组位置，并提供位点特异性组蛋白磷酸化。M6CK组蛋白磷酸化反过来通过减弱局部精氨酸甲基化的作用来调节转录[10]。

综上所述，TRPM6是一种双功能蛋白，在全身镁稳态中发挥着核心作用。其功能失调与低镁血症伴随继发性低钙血症相关。此外，TRPM6在胎儿和成体生物中的可能功能包括骨骼生成、黑色素细胞形成、胸腺生成、细胞粘附以及早期发育中的神经褶闭合等。在胃肠道癌症中，TRPM6的表达失调可能与肿瘤的发生和发展相关。TRPM6的激酶结构域在细胞核中具有组蛋白磷酸化活性，这可能通过减弱局部精氨酸甲基化的作用来调节转录。因此，TRPM6的研究对于深入理解其在Mg2+处理中的作用、疾病发生机制以及可能的临床治疗靶点具有重要意义。