Prap1-flox 基因敲除小鼠

Prap1基因，即编码脯氨酸富含酸性蛋白1（PRAP1）的基因，在细胞生物学和生理学中发挥着多方面的作用。PRAP1是一种在多种细胞类型中表达的蛋白质，包括胎盘细胞、胃肠道上皮细胞和血管内皮细胞。该蛋白质参与细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞凋亡和细胞应激反应等多种生物学过程。PRAP1的异常表达或功能改变与多种疾病的发生发展密切相关，如癌症、炎症性疾病和心血管疾病等。

在胎盘细胞中，PRAP1的表达受到环境压力的影响。例如，砷暴露会导致胎盘细胞中PRAP1的表达显著上调[1]。研究发现，砷暴露后，PRAP1在26种胎盘细胞类型中表达增加，包括多种滋养层细胞。此外，砷暴露还会导致女性中PRAP1的表达水平升高，并使其在胎盘中的定位发生改变。体外和离体实验证实，砷处理可以上调PRAP1的表达，而重组PRAP1蛋白可以降低砷诱导的细胞毒性，并下调人滋养层细胞中的细胞周期通路。PRAP1敲低后，细胞周期过程、增殖和细胞死亡受到不同影响，这取决于砷的存在与否。这些发现为理解胎盘对环境压力的反应提供了新的见解，并为预防环境相关的不良妊娠结局提供了潜在的预防和治疗策略。

PRAP1在细胞生存和DNA损伤修复中也发挥着重要作用。研究发现，DNA损伤条件下，p53可以上调PRAP1的表达。p53是细胞对多种基因毒性压力反应的关键调节因子。在DNA损伤条件下，p53可以激活细胞衰老或细胞周期阻滞和DNA修复，以维持细胞生存和基因组完整性，或者引导细胞发生凋亡以消除受损严重的细胞。p53执行这两种相反细胞命运的能力取决于其下游的信号通路。研究发现，在化疗药物诱导的DNA损伤、γ射线照射和过氧化氢处理的条件下，p53可以上调PRAP1的表达。此外，研究者还发现PRAP1基因的内含子1中存在功能性p53反应元件，这些元件可以直接与p53相互作用。p53诱导的PRAP1表达可能促进癌细胞对化疗药物的耐药性，因为PRAP1敲低可以增加癌细胞在5-氟尿嘧啶治疗后的凋亡。PRAP1似乎通过诱导细胞周期阻滞来保护细胞免受凋亡，这表明p53在DNA损伤剂诱导下上调PRAP1表达可能有助于癌细胞生存。这些发现为理解p53在细胞毒性治疗中的促生存作用机制提供了新的见解。

PRAP1还在胃肠道上皮细胞中发挥着保护作用。研究发现，PRAP1在胃肠道上皮细胞中高度表达，并保护其免受辐射诱导的细胞凋亡。肠道上皮细胞必须能够抵抗生理化学压力，以维持将全身隔离开肠道腔内微生物和抗原成分的生理屏障。研究者发现，口服摄入益生菌鼠李糖乳杆菌GG不仅可以诱导小鼠结肠中多种已知的细胞保护因子的表达，还可以诱导许多以前未描述功能的基因的表达，包括编码PRAP1的基因。PRAP1是一种17-kDa的内在无序蛋白，没有可识别的序列同源性。PRAP1在小肠上皮中表达水平很高。虽然Prap1敲除小鼠在基线时只表现出轻微的表型，但在受到辐射损伤时表现出高度易感性。辐射后，Prap1敲除小鼠的死亡率加速，小肠上皮中的凋亡和p21表达显著增加。这些发现表明，PRAP1是一种内在无序蛋白，在小肠上皮中高度表达，并在暴露的表面发挥作用，以保护屏障免受氧化应激的损害。

PRAP1还参与基因转移中的非病毒载体表达抑制。研究发现，ZNF511-PRAP1可能参与转染质粒的识别和失活。非病毒载体在基因转移中具有比病毒载体更大的优势。然而，转染基因的低表达效率限制了它们在基因治疗中的应用，这主要归因于这些载体无法克服各种障碍，包括生物障碍。研究发现，质粒DNA转染可以诱导ZNF511-PRAP1的表达，并抑制转染质粒的转录。ZNF511-PRAP1可以直接结合转染质粒中的p21启动子，但不会结合内源性的p21启动子。同样，ZNF511-PRAP1可以抑制瞬时转染质粒上的绿色荧光蛋白报告基因的表达，但不会抑制整合有相同细胞巨化病毒（CMV）启动子的红色荧光报告基因的表达。因此，ZNF511-PRAP1可以区分外源/非整合和内源/整合DNA。ZNF511-PRAP1的抑制与DNA甲基化无关，并且可以通过曲古抑菌素A（TSA）处理和敲低HDAC2和/或ZNF511-PRAP1来消除。此外，ZNF511-PRAP1可以直接与HDAC2相互作用。这些结果表明，转染质粒可以被ZNF511-PRAP1识别并抑制，并且被由ZNF511-PRAP1和HDAC2组成的抑制复合物抑制。这表明ZNF511-PRAP1可能作为非病毒基因转移中的潜在分子障碍发挥作用。

PRAP1的表达还受到父亲吸烟的影响。研究发现，父亲在妊娠前的吸烟与后代DNA甲基化有关。实验研究表明，暴露可能通过影响呼吸道健康的跨代传递，通过男性生殖细胞特异性地传递表观遗传变化。然而，人类中的研究是有限的。研究者旨在确定与父亲妊娠前吸烟相关的后代的表观遗传标记。他们使用Infinium MethylationEPIC Beadchip芯片在RHINESSA队列（7-50岁）中进行了全表观基因组关联研究（EWAS），研究对象包括父亲妊娠前吸烟（n=875名后代）和青春期开始吸烟<15岁（n=304名）的父亲。他们还进行了母亲和后代个人吸烟的EWAS进行比较。研究者发现，父亲妊娠前开始吸烟与后代血液DNA中的两个胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点（CpG）的甲基化有关，FDR<0.05。青春期开始吸烟的父亲与19个CpG位点相关，FDR<0.05，这些位点位于14个基因中，包括TLR9、DNTT、FAM53B、NCAPG2、PSTPIP2、MBIP、C2orf39、NTRK2、DNAJC14、CDO1、PRAP1、TPCN1、IRS1和CSF1R。这些差异甲基化位点被过度甲基化，并与具有基因沉默能力的启动子区域相关。其中一些位点与该队列中的后代结局相关，包括曾经患有哮喘（NTRK2）、曾经有喘息（DNAJC14、TPCN1）、体重（FAM53B、NTRK2）和体重指数（FAM53B、NTRK2）。通路分析显示，与基因表达调控、炎症和先天免疫反应相关的基因本体通路富集。父亲吸烟相关的位点与个人和母亲吸烟的EWAS中确定的差异甲基化位点不重叠。这些发现表明，父亲妊娠前吸烟，尤其是在青春期，与后代DNA甲基化有关，这为流行病学研究提供了证据，即青春期父亲的吸烟增加了后代哮喘、低肺功能和肥胖的风险。

PRAP1在微血管内皮细胞中发挥着重要作用。研究发现，ATF3和PRAP1在顺铂诱导的微血管内皮细胞损伤中发挥着重要作用。顺铂是一种典型的化疗药物，早期干预是降低癌症患者心血管疾病死亡率的一种合理方法。研究者试图确定顺铂诱导的微血管内皮细胞损伤的潜在生物标志物，并探讨其潜在的机制。他们利用微阵列数据集GSE62523评估了人微血管内皮细胞（HMEC-1）在顺铂处理后的基因差异表达。然后，他们通过qRT-PCR进一步验证了潜在的基因，并通过评估γH2AX水平来监测顺铂诱导的DNA损伤。在“急性暴露”设置中，HMEC-1细胞用12.9μM顺铂处理6、24和48小时，研究者发现ATF3、LRRTM2、VCAM1和PAPPA是内皮损伤的潜在关键基因。在“慢性暴露”设置中，细胞每周两次暴露于0.52μM顺铂，研究者发现SULF2、ACTA2和PRAP1是关键基因。此外，进一步的体外验证表明，敲低ATF3可以降低细胞在6或24小时顺铂暴露后的γH2AX水平，而敲低PRAP1可以增加细胞在2天顺铂暴露后的γH2AX水平。值得注意的是，ATF3可以调节HIST1H1D、FBXO6、APP、MDM2、STAT1和TRAF1的表达，而PRAP1在顺铂诱导的DNA损伤修复过程中调节YWHAB、MDM2、ISG15、LYN和CUL1的表达。ATF3和PRAP1在顺铂诱导的DNA损伤修复过程中发挥着重要作用，它们可能作为接受化疗的癌症患者微血管内皮损伤的潜在早期替代生物标志物。

PRAP1在肝细胞癌（HCC）中发挥着重要的调节作用。研究发现，PRAP1是MAD1的相互作用伙伴，并抑制有丝分裂检查点信号传导。细胞有丝分裂检查点的丧失会导致染色体不稳定性，从而引发癌症。有丝分裂缺陷1（MAD1）是有丝分裂检查点信号传导中的关键成分。研究者使用酵母双杂交筛选技术鉴定出了一种新的MAD1相互作用伙伴，即PRAP1，并研究了其在HCC中的有丝分裂检查点信号传导中的作用。他们使用共免疫沉淀实验证实了PRAP1与MAD1和MAD1β亚型的物理相互作用。此外，他们在有丝分裂检查点功能正常的HCC细胞BEL-7402和SMMC-7721中稳定表达PRAP1，导致有丝分裂检查点受损、染色体桥的形成和染色体数目异常。有趣的是，在HCC细胞中过表达PRAP1导致MAD1显著下调。在人类HCC肿瘤中，与对应非肿瘤性肝脏相比，40.4%（23/57）的HCCs显示PRAP1蛋白表达下调；MAD1蛋白的上调与PRAP1的下调显著相关（p=0.030）。这些数据表明，PRAP1是MAD1的相互作用伙伴，并且PRAP1能够下调MAD1并抑制HCC中的有丝分裂检查点信号传导。

PRAP1在子宫内膜中的作用也得到了研究。研究发现，ARID1A和PGR在胚胎着床和早期妊娠期间的蜕膜化中发挥着重要作用。子宫特异性Arid1a敲除小鼠（Pgrcre/+Arid1af/f）在妊娠第3.5天（GD 3.5）表现出非接受性子宫内膜。在先前的研究中，研究者利用Pgrcre/+Arid1af/f小鼠子宫的转录组分析，发现PRAP1是ARID1A在子宫中下调的基因之一。在早期妊娠期间，PRAP1在妊娠第0.5天（GD 0.5）的子宫内膜和间质中表达强烈，然后在GD 3.5时下降。在着床后，PRAP1在子宫中的表达显著降低。然而，在Pgrcre/+Arid1af/f小鼠中，GD 3.5时PRAP1的表达显著增加。为了确定卵巢类固醇激素对PRAP1的调节，研究者检查了卵巢切除对照组、Pgrcre/+Arid1af/f小鼠和孕酮受体敲除（PRKO）小鼠在接受孕酮处理后的PRAP1表达。虽然对照组小鼠在接受溶剂处理后PRAP1蛋白在腔上皮和腺上皮中表达强烈，但孕酮处理抑制了PRAP1的表达。然而，与对照小鼠相比，Pgrcre/+Arid1af/f和PRKO小鼠中的PRAP1没有被抑制。这些结果表明，PRAP1是ARID1A和PGR在小鼠子宫中的新靶标。

PRAP1还受到雌激素的影响。研究发现，对甲氧基苯酚（PhOP）和戊氧基苯酚（PeOP）属于醚类化合物，广泛应用于工业和农业生产以及日常用品中。p-烷氧基苯酚（AOPs）是醚类化合物的一类，广泛应用于工业和农业生产以及日常用品中。PhOP和PeOP属于这类化合物，并在体外被报道具有雌激素活性。然而，它们的体内雌激素活性很少受到关注。研究者进行了未成熟小鼠子宫肥大实验，并研究了这两种化合物在小鼠中的雌激素效应。结果发现，与PeOP处理的小鼠相比，PhOP处理的小鼠在30和300 mg/kg bw/天剂量下，连续3天（P<0.05）的子宫重量显著增加。此外，研究者还分析了PhOP和PeOP处理的小鼠子宫组织中基因表达。PhOP和PeOP处理的样本的基因调控模式与17β-雌二醇（E2）处理的样本相似。特别是，一些雌激素反应基因，如Sprr2基因家族、Apoa1、Prap1和Ahsg，表现出与E2相似的调控趋势。此外，分子对接分析表明，PhOP和PeOP可以很好地结合到hERα的活性位点，其势能平均值（PMF）值分别为-58.68和-52.67 kcal/mol。这些结果表明，PhOP表现出相对较强的体内雌激素活性，这可能是未来的关注点。

PRAP1还与microRNA-125a-3p的表达相关。研究发现，microRNA-125a-3p过表达通过靶向PRAP1促进肝脏再生。肝脏再生对肝切除术具有重要意义，主要由肝细胞增殖驱动。MicroRNA-125a-3p据报道与肝脏再生过程密切相关。研究者研究了miR-125a-3p在肝脏再生中的功能作用机制。他们构建了miR-125a-3p模拟物和抑制剂载体，并将其转染入原代人肝HL-7702细胞中，使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测转染细胞的活力。通过流式细胞术分析细胞周期分布。通过Targetscan和OUGene预测，他们使用实时定量PCR（qPCR）和荧光素酶报告基因实验依次验证了miR-125的潜在靶点。他们构建了PRAP1过表达载体，并将其与miR-125a-3p模拟物共转染入HL-7702细胞中，检测增殖能力和细胞周期分布的变化。通过Western印迹和qPCR分析基因表达。过表达miR-125a-3p显著增加了48小时后肝细胞的活力，并减少了G1期细胞的数量（p<0.05）。然而，miR-125a-3p抑制抑制了肝细胞的发展。PRAP1是miR-125a-3p的靶点。在共转染PRAP1载体后，肝细胞活力降低，G1期细胞数量增加（p<0.05）。更重要的是，过表达PRAP1显著降低了细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）和细胞分裂周期25A（CDC25A）的mRNA和蛋白水平。过表达miR-125a-3p与肝细胞活力和细胞周期进展正相关，这是由于PRAP1的调节。miR-125a-3p可能有助于改善肝脏再生。

综上所述，PRAP1是一种在多种细胞类型中表达的蛋白质，参与细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞凋亡和细胞应激反应等多种生物学过程。PRAP1的异常表达或功能改变与多种疾病的发生发展密切相关，如癌症、炎症性疾病和心血管疾病等。PRAP1在胎盘细胞、胃肠道上皮细胞、血管内皮细胞和肝脏细胞等多种细胞类型中发挥着重要的生物学功能。PRAP1的研究有助于深入理解其在各种生物学过程中的作用机制，并为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。