Ube3a-flox 基因敲除小鼠

Ube3a基因是一种编码E3泛素连接酶的基因，它在人类大脑中表现出基因组印记的特征。这意味着，在神经元中，只有母源性的Ube3a基因会被表达，而父源性的基因则被沉默。这种印记现象对大脑发育至关重要，因为Ube3a基因的异常会影响神经系统的正常功能。例如，如果母源性的Ube3a基因发生突变或缺失，会导致一种名为安格曼综合症（AS）的神经发育障碍。AS患者通常表现为智力障碍、语言障碍、癫痫发作、共济失调以及一些独特的行为特征[1]。

Ube3a基因的进化起源可以追溯到真菌和动物的共同祖先。在人类HECT家族的E3泛素连接酶中，Ube3a与HECTD2最为相似。有趣的是，虽然Ube3a在鸟类、单孔目动物、有袋动物和昆虫中都是双等位基因表达，但在小鼠和人类中却是母源印记表达的。这种印记表达的进化可能发生在有袋类动物和胎盘哺乳动物分化之后，经过多次染色体重排形成[1]。

染色体15q11.2-q13.1区域的重复综合征（Dup15q综合征）是一种严重的神经发育障碍，其特征是智力障碍、运动协调障碍和自闭症谱系障碍。UBE3A基因的扩增被认为是Dup15q综合征的主要致病因素。然而，关于UBE3A基因过表达对小鼠神经发育的影响的研究结果却存在分歧。一项研究使用了细菌人工染色体为基础的转基因小鼠模型（Ube3aOE），该模型复制了Dup15q中常见的UBE3A拷贝数增加。结果显示，Ube3aOE小鼠在许多分子和行为指标上与野生型小鼠没有区别，尽管在遭受癫痫发作时死亡率增加，这一现象与癫痫的突然意外死亡相似[2]。

为了治疗AS，基因治疗是一种很有潜力的方法。研究表明，重组腺相关病毒（rAAV）表达小鼠Ube3a可以挽救AS小鼠模型的缺陷。进一步的研究发现，使用rAAV表达人UBE3A基因也可以成功复制这一结果。此外，为了解决病毒载体在脑内分布有限的问题，研究人员开发了一种新型的UBE3A蛋白形式，称为STUB。STUB蛋白被设计成带有分泌信号和细胞穿透肽，使得转导细胞可以作为生产UBE3A蛋白的工厂，其蛋白可以被邻近的非转导细胞摄取，从而增加接受治疗蛋白的神经元数量。结合rAAV-STUB与脑室内注射，可以最大限度地提高rAAV在脑内的分布，从而改善AS大鼠模型中的行为和电生理缺陷。与表达正常人类UBE3A基因的rAAV相比，STUB显示出更有效的治疗效果[3]。

除了基因治疗，反义寡核苷酸（ASO）治疗也是一种很有前景的治疗方法。AS是一种由UBE3A基因突变引起的严重神经发育障碍，目前只有对症治疗，效果有限。AS是由影响母源性UBE3A基因的突变引起的。以前的研究表明，通过靶向反义UBE3a-ATS转录本，可以激活沉默的父源性Ube3a基因。一项研究发现，在出生后第一天（P1）或P21对AS小鼠进行单次脑室内注射ASO，可以在大脑中有效地、特异性地恢复UBE3A的表达，皮质中UBE3A的水平达到野生型水平的74%，并完全恢复了听觉诱发癫痫的敏感性。在P1接受ASO治疗的AS小鼠也表现出对已建立的AS表型的挽救，如旷场和强迫游泳测试的行为，以及在反向转棒测试中的显著改善。经治疗AS小鼠的海马可塑性可与野生型小鼠相比，但与PBS治疗的AS小鼠没有显著差异。没有观察到对埋石和筑巢表型的挽救。这些发现突出了ASO介导的UBE3A再激活作为AS疾病修饰治疗的潜力[4]。

UBE3A是一种双功能蛋白，具有泛素连接酶和转录共激活因子的功能。UBE3A基因在大脑中印记表达，尤其是在神经元中，母源性表达优先。母源性UBE3A活性的丧失会导致安格曼综合症（AS），其特征是严重的智力障碍、缺乏语言、癫痫发作和自闭症特征。有趣的是，UBE3A基因的复制、三倍体或获得功能突变也与自闭症有关，自闭症的临床特征是社交障碍和刻板行为。这些发现表明，UBE3A的表达和活性在脑发育过程中必须得到严格的调节，UBE3A可能在通过蛋白酶体介导的降解和转录调节其靶蛋白的表观遗传修饰来控制突触功能和可塑性方面发挥着重要作用[5]。

UBE3A基因位于15q11-13染色体区域，受到神经元特异性基因组印记的影响，并在脑发育中发挥着关键作用。UBE3A基因的遗传缺陷会导致严重的神经发育障碍，即安格曼综合症（AS）和15q11.2-q13.3重复综合征（Dup15q）。在过去二十年里，AS和Dup15q的体外和体内模型的发展对提高对UBE3A在大脑中功能理解至关重要。然而，这些疾病的致病机制仍然不明，有效的治疗方法仍然缺乏。最近的证据表明，UBE3A的功能在空间和时间上都是特定的，在不同亚细胞区室、脑区和神经元回路中变化。在目前的综述中，我们总结了UBE3A在神经元病理生理学中作用的知识，并从空间和时间角度提出了一些关键的研究问题，这将有助于更好地理解AS和Dup15q障碍的致病机制，并为开发新的治疗方法提供依据[6]。

15q11-13区域是人类基因组中最复杂的染色体区域之一。UBE3A是自闭症谱系障碍（ASD）的一个重要候选基因，位于15q11-13区域，编码泛素蛋白连接酶E3A。关于UBE3A基因和ASD的研究结果表明结果不一致，并且在中国人群中进行的此类研究很少。一项研究旨在检测中国汉族自闭症人群UBE3A基因的基因突变，并分析这些变异与ASD之间的遗传相关性。该研究收集了192例符合DSM-IV诊断标准的自闭症患者的样本和192例健康对照样本。使用高分辨率熔解（HRM）和Sanger测序方法，对UBE3A基因的编码序列（CDS）区域及其相邻的非编码区域进行了突变搜索。进一步增加了样本量，以使用HRM验证检测到的变异，并进行了病例组与对照组之间的关联分析。使用Sanger测序方法检测到一个已知的单核苷酸多态性（T>C，rs150331504），位于CDS4，以及一个已知的5bp插入/缺失变异（AACTC+/-，rs71127053），位于CDS2上游288bp的内含子区域。病例组的ASD样本分别为391例（rs71127053）、384例（rs150331504）和384例健康对照，用于进行关联分析。关联分析结果显示，在扩大样本量后，病例组和对照组之间rs71127053和rs150331504的等位基因和基因型频率没有显著差异。此外，rs150331504是一种同义突变，我们使用RNAfold软件比较了带有rs150331504 T或C等位基因的mRNA的二级结构和最低自由能（MFE）。我们发现，随着rs150331504 T>C的多态性，质心二级结构明显不同，这表明这种变异可能会改变UBE3A基因mRNA的二级结构。我们没有在其他UBE3A基因的编码区域检测到突变。这些发现表明，UBE3A基因可能不是中国ASD病例的主要致病基因[7]。

安格曼综合症（AS）的特点是严重的发育迟缓，包括显著的言语障碍、运动异常（共济失调、震颤）以及独特的频繁发笑行为，这是由于母源性UBE3A基因（母源性15q11-13缺失、母源性特定UBE3A突变、单亲二倍体和印记缺陷）功能障碍造成的。80-90%的AS患者从儿童早期开始就患有难治性癫痫发作，并伴有特征性EEG异常。潜在的病理生理学可能涉及由于GABA能输入严重减少而导致的皮质和丘脑皮质过度兴奋，以及突触可塑性功能障碍、突触生成缺陷和神经元形态学不成熟。癫痫发作的起始最常见于1至3岁之间；然而，大约25%的患者在一岁之前就发展成癫痫。最常见的是全面性发作，其中最常见的类型是肌阵挛和失神发作。超过95%的癫痫患者可能在儿童早期至少有一段时间每天发作，三分之二的患者发展成致残性发作。发热诱发的发作和频繁发生的非惊厥性癫痫持续状态是两个独特的特征。发作通常对药物治疗有抵抗力。鉴于GABA能功能障碍的突出表现，临床医生使用针对GABA能信号传导的AEDs，如丙戊酸、苯巴比妥和氯硝西泮作为AS的一线治疗方案。然而，由于这些AEDs的不利副作用，最近的治疗方法包括优先使用左乙拉西坦、氯巴占、托吡酯、拉莫三嗪、乙琥胺、VNS和低碳水化合物饮食。除了对症治疗外，最近在寻找治愈性治疗方法方面取得了进展，包括：1.基因/蛋白质替代疗法（使用腺病毒和慢病毒载体传递基因或分泌蛋白）；2.激活完整的但沉默的父源性UBE3A（反义寡核苷酸疗法和人造转录因子）；3.下游疗法（OV101/gaboxadol、酮类补充剂、新型化合物/肽、抗炎/再生疗法）[8]。

安格曼综合症（AS）是一种严重的神经发育障碍，其原因是母源性UBE3A等位基因发生突变或缺失。在神经元中，父源性UBE3A等位基因被一种名为UBE3A-ATS的长非编码RNA沉默。在系统筛选过程中，研究人员发现，当靶向Snord115基因时，Cas9可以用来激活（解沉默）培养的小鼠和人神经元中的父源性Ube3a。一个短Cas9变体和针对约75个Snord115基因的引导RNA被包装到腺相关病毒中，并在胚胎和早期产后阶段给予AS小鼠模型，此时预测恢复Ube3a的治疗效果最大。这种早期治疗至少在17个月内使父源性Ube3a在整个大脑中解沉默，并挽救了AS小鼠的解剖和行为表型。腺相关病毒载体在Cas9靶点上的基因组整合导致UBE3a-ATS在载体衍生的polyA盒处过早终止，或者当以反向方向整合时，通过载体衍生的Cas9转录本转录碰撞而终止。这项研究表明，基因治疗载体的靶向基因组整合可以恢复父源性UBE3A在整个生命周期中的功能，为一种综合征性神经发育障碍的疾病修饰治疗开辟了道路[9]。

UBE3A是一种与神经发育障碍相关的基因。UBE3A蛋白产物是E6相关蛋白（E6AP），其在大脑中的表达是通过基因组印记独特地调节的。E6AP表达的丧失会导致安格曼综合症（AS），其临床特征是缺乏语言、运动发育异常和癫痫发作。相反，导致E6AP过表达的拷贝数变异（CNVs）与自闭症谱系障碍（ASDs）的发展密切相关，自闭症谱系障碍的特征是沟通减少、社交兴趣受损和重复行为增加。在这篇综述文章中，我们重点关注了Ube3A/E6AP的神经生物学功能。作为E3连接酶，已经发现许多E6AP的功能性靶蛋白，包括p53、Arc、Ephexin5和SK2。在神经元水平上，E6AP在细胞内广泛表达，包括树突树突、突触和细胞核。E6AP调节神经元形态学的成熟，并在突触可塑性和皮质发育中发挥着重要作用。这些分子发现为我们理解AS和ASDs背后的分子事件提供了见解[10]。

综上所述，Ube3a基因是一种编码E3泛素连接酶的基因，它在神经元中表现出母源性印记表达。Ube3a基因的异常会导致安格曼综合症（AS），这是一种严重的神经发育障碍。基因治疗和反义寡核苷酸治疗等治疗方法显示出对AS的潜力。UBE3A的表达和活性在脑发育过程中必须得到严格的调节，UBE3A可能在通过蛋白酶体介导的降解和转录调节其靶蛋白的表观遗传修饰来控制突触功能和可塑性方面发挥着重要作用。这些研究为理解AS和自闭症谱系障碍的致病机制提供了重要的见解，并为开发新的治疗方法提供了依据。