Nkx2-1-flox 基因敲除小鼠

Nkx2-1，也称为甲状腺转录因子-1（TTF-1）或甲状腺特异性增强子结合蛋白（T/EBP），是一种含有同源结构域的转录因子。Nkx2-1在甲状腺、肺和前脑的形态发生和分化中起着至关重要的作用。它在甲状腺、肺和中央神经系统中控制特定基因的表达。在肺中，Nkx2-1调节表面活性蛋白的表达，这对于肺稳定性和肺宿主防御至关重要。人类Nkx2-1基因位于第14染色体上，由两个或三个外显子和一个或两个内含子组成。多个转录起始位点和选择性剪接产生具有5'端异质性的mRNA。Nkx2-1 mRNA的3'端具有较长的非翻译区域。人类、大鼠、小鼠和其他物种的Nkx2-1氨基酸序列非常相似，表明序列高度保守。Nkx2-1启动子活性由HNF-3、Sp1、Sp3、GATA-6和HOXB3转录因子的组合或协同作用维持。关于激素、细胞因子和其他生物剂对Nkx2-1基因表达的调节信息有限。糖皮质激素、cAMP和TGF-β对Nkx2-1表达有刺激作用，而TNF-α和神经酰胺对肺细胞中的Nkx2-1 DNA结合活性有抑制作用。人类中Nkx2-1的单倍体不足会导致甲状腺功能减退、呼吸功能障碍和反复肺部感染，强调了维持甲状腺和肺功能的最优Nkx2-1水平的重要性。最近的研究将Nkx2-1确定为肺癌的谱系特异性原癌基因[1]。

在良性结节性甲状腺肿组织中，H19 lncRNA过度表达，其靶点尚不清楚。在甲状腺发育过程中，通过相互作用能量计算，检查了Nkx2-1 mRNA和H19 lncRNA之间的相互作用。在H19 lncRNA靶位点发现了假定的microRNA，该位点对Nkx2-1具有最高的亲和力。通过分析RNAseq数据，确定了基因表达的组织特异性。在甲状腺切除术期间，从18个甲状腺肿和18个正常组织中取样。使用特异性引物通过RT-qPCR确定Nkx2-1的表达。Nkx2-1与H19之间的相互作用由六个局部碱基对连接组成，最大能量为-20.56kcal/mol。特别是，显示与H19结合亲和力最高的序列与has-miR-1827结合到Nkx2-1的位点重叠。发现Nkx2-1仅在正常甲状腺组织中与H19共表达。与相邻的正常组织相比，结节性甲状腺肿组织显著过度表达Nkx2-1（相对表达=1.195，p=0.038）。Nkx2-1已被确定为H19 lncRNA的假定靶点，该lncRNA在结节性甲状腺肿组织中显著过度表达[2]。

先天性甲状腺功能减退症（CH）的发生率在墨西哥人群中异常高，但原因尚不清楚。NKX2-1作为候选基因，在122名无亲缘关系的墨西哥CH/TD患者中进行了自动化Sanger测序。尽管本研究包括迄今为止在TD相关CH患者中分析的NKX2-1的最大数量，但未检测到致病性变异；仅确定了三种良性多态性变化。这些结果表明，NKX2-1不是CH或其在墨西哥高发病率的主要原因。我们的工作确定了三个先前发表报告中NKX2-1变异的误注释[3]。

T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）是未成熟的淋巴细胞肿瘤，定位于骨髓、纵隔、中枢神经系统和淋巴器官。它们占儿童和约25%成人急性淋巴细胞白血病（ALL）病例的10-15%。这是一种广泛异质性疾病，由随时间积累的多个遗传异常的共存引起，一旦积累，就会导致完全的白血病。反复受影响的基因失调关键的细胞过程，如循环（CDKN1B、RB1、TP53）、信号转导（RAS途径、IL7R/JAK/STAT、PI3K/AKT）、表观遗传学（PRC2成员、PHF6）和蛋白质翻译（RPL10、CNOT3）。NOTCH1和CDKN2A起着重要作用，因为它们在超过一半的病例中被改变。NOTCH1信号的激活影响胸腺细胞的特化和发育，而CDKN2A的杂合子不足/失活，则促进细胞周期进程。在反复涉及的癌基因中，T细胞特异性转录因子起着重要作用，其失调表达干扰正常的胸腺细胞发育，并导致特定阶段的分化阻滞。因此，TAL和/或LMO失调是成熟表型（sCD3阳性）的T-ALL的典型特征；而TLX1、NKX2-1或TLX3则是皮质T-ALL（CD1a阳性）的典型特征；HOXA和MEF2C则在早期T细胞前体（ETP；不成熟表型）和早期T-ALL的某些亚组中过表达。在不成熟的T-ALL中，导致BCL11B转录失调的基因组改变，确定了特定的遗传亚组。尽管全面的细胞遗传学和分子学研究揭示了T-ALL的遗传背景，但目前尚未在T-ALL的诊断流程中采用生物标志物，只有少数研究评估了它们在临床上的意义。在这篇综述中，我们将重点关注定义特定白血病发生途径的反复T-ALL异常，以及可以作为诊断生物标志物的癌基因/肿瘤抑制因子。此外，我们还将讨论如何利用T-ALL复杂的基因组特征来应对和测试创新的/靶向的治疗方案[4]。

长非编码RNA（lncRNA）的子集在基因组中与转录因子（TF）在空间上相关，但lncRNA-TF基因二聚体如何调节组织发育和稳态尚不清楚。我们发现NANCI（Nkx2.1相关非编码间基因RNA）-Nkx2.1基因二聚体内的反馈回路对于缓冲Nkx2.1表达、肺上皮细胞身份和组织稳态至关重要。在这个位点内，Nkx2.1直接抑制NANCI，而NANCI则以顺式作用促进Nkx2-1的转录。尽管NANCI的丢失本身不会对肺发育产生不利影响，但NANCI和Nkx2-1的同时杂合子突变会导致持续的Nkx2-1缺乏和肺上皮细胞重编程为后肠命运。NANCI-Nkx2.1基因二聚体的这种破坏导致出生后先天性免疫反应缺陷、组织损伤和成人肺的进行性退化。这些数据表明，lncRNA作为lncRNA-TF基因二聚体位点内的变阻器，缓冲TF表达，从而在发育和出生后稳态期间维持组织特异性细胞身份[5]。

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，肺腺癌是最常见的肺癌亚型。在所有肺腺癌中，最常见的亚型通过从非典型腺瘤样增生（AAH）到原位腺癌（AIS），到微浸润性腺癌（MIA），再到明显的浸润性腺癌具有鳞状模式的多步骤进展发展。这种逐步发展得到了这些肿瘤的 clinicopathological 和分子特征的支撑。在2015年世界卫生组织分类中，AAH和AIS都被定义为侵袭前病变，而MIA被识别为早期侵袭性腺癌，如果完全切除，则不会复发。最近的研究检查了肺腺癌肿瘤发生和进展的分子特征。EGFR突变的腺癌通常通过多步骤进展发展。癌基因诱导的衰老似乎降低了KRAS或BRAF突变的腺癌中多步骤进展的频率，其肿瘤进化可能与表观遗传改变和激酶非活性突变相关。本综述总结了目前对早期肺腺癌肿瘤发生和肿瘤进展的了解，特别关注其 clinicopathological 特征及其与驱动突变（EGFR、KRAS和BRAF）以及其分子发病机制和进展的相关性[6]。

由于碘浓度和过氧化物酶活性的相似性，脊椎动物的甲状腺被认为起源于无脊椎脊索动物的咽腔，尽管它是一个粘液产生（mucus-producing）的腺体（glandular organ）用于水生悬浮喂养。在具有咽腔的脊索动物中，尾索动物是研究脊椎动物特征的进化研究模型。被囊动物Ciona intestinalis形成一个具有腺体和甲状腺相关元素特定成分的咽腔，并已为这些成分确定了分子标记。由于我们之前检查了尾海鞘动物Oikopleura dioica中的简单咽腔，在本研究中通过TALEN介导的基因敲除干扰了Ciona Nkx2-1和FoxE的表达，以阐明复杂被囊动物咽腔的共享和/或不同特征。Ciona Nkx2-1和FoxE的敲除对发育中的咽腔形态产生了不同的影响。Nkx2-1的敲除消除了腺体和甲状腺分化标记基因的表达，例如vWFL1、vWFL2、CiEnds1、TPO和Duox，而FoxE的敲除则消除了分化标记基因TPO和CiEnds1的表达。Nkx2-1和FoxE敲除幼体的发育不良咽腔中，支持元素相关的Pax2/5/8a、Pax2/5/8b、FoxQ1和β-微管蛋白的表达持续存在。尽管被囊动物特异性CiEnds1的基因调控尚不清楚，但这些结果为了解脊椎动物甲状腺的进化以及尾索动物咽腔提供了见解[7]。

先天性甲状腺功能减退症（CH）在婴儿中发生的频率相对较高，如果不及早诊断和治疗，它对神经系统发育的影响可能是灾难性的。CH与编码负责甲状腺发育的转录因子的几个基因中的遗传变化有关，包括NK2同源框1（NKX2.1）基因的突变，该基因编码甲状腺转录因子-1（TTF-1）。尽管CH在儿科人群中经常观察到，但对导致该疾病的遗传因素和分子机制的了解仍然有限。通过聚合酶链反应（PCR）、单链构象多态性（SSCP）和直接DNA测序，对75名患有CH的儿科患者的NKX2.1基因序列进行了研究。在NKX2.1基因的第3外显子中发现了四种错义杂合子变异，包括三种新的错义变异，即c.708A>G，p.Gln202Arg；c.713T>G，p.Tyr204Asp；c.833T>G，p.Tyr244Asp，以及先前报道的变异rs781133468（c.772C>G，p.His223Gln）。重要的是，这些变异发生在TTF-1 DNA结合域的高度保守残基中，并通过生物信息学分析预测，它们会改变蛋白质结构，可能会改变蛋白质功能。这些结果表明，NKX2.1基因中的核苷酸变化可能有助于CH的发病机制[8]。

肺癌的主要驱动突变，包括EGFR突变和EML4-ALK融合，主要在终末呼吸单元（TRU）型肺腺癌中发现，它们通常表现出鳞状和/或乳头状模式，但很少与实性或浸润性粘液性形态相关。为了阐明非TRU型肺癌的关键遗传事件，我们对43例基于形态的非TRU型肺腺癌（17例腺泡型、9例实性、2例肠型腺癌和15例具有粘液性形态的腺癌）进行了全外显子测序。我们的分析确定了TP53（16/43，37.2%）、KRAS（13/43，30.2%）和NKX2-1/TTF-1（7/43；16.3%）为前三大显著突变基因，而EGFR突变在本队列中很少见（1/43，2.3%）。发现了八种NKX2-1/TTF-1突变（五种移码、两种无义和一种错义），其中一例携带两种不同的NKX2-1/TTF-1突变（一种错义和一种移码）。使用NK2同源框1（NKX2-1）/甲状腺转录因子1（TTF-1）突变体的功能实验表明，它们中没有一种保留了转录因子的活性。在组织学上，浸润性粘液性腺癌占NKX2-1/TTF-1突变的大多数（5例），以及1例肠型和1例腺泡型腺癌。免疫组化显示，该队列主要分为TTF-1阳性/肝细胞核因子4-α（HNF4-α）阴性组和TTF-1阴性/HNF4-α阳性组。NKX2-1/TTF-1突变仅发现于后者，其中胃肠道标记物粘蛋白5AC和细胞角蛋白20经常表达。亚硫酸氢盐测序显示，NKX2-1/TTF-1基因体在NKX2-1/TTF-1阴性病例中高度甲基化，包括没有NKX2-1/TTF-1突变的病例。NKX2-1/TTF-1的遗传或表观遗传失活可能在非TRU型肺腺癌的发育和异常分化中发挥重要作用[9]。

肺泡，是空气呼吸生物体特有的，从多能干细胞（PSCs）中生成一直具有挑战性，部分原因是缺乏提供必要发育路线图的有限模型系统。在这里，我们报告了从人PSCs中生成肺泡上皮细胞2型（AEC2s），肺泡的潜在祖细胞。使用多色荧光报告基因系，我们跟踪和纯化了人类SFTPC+肺泡祖细胞，它们在Wnt和FGF信号刺激下从内胚层前体中产生。纯化的PSC衍生SFTPC+细胞在3D培养中无需间充质支持即可形成单层上皮“肺泡体”，表现出自我更新能力，并显示其他AEC2功能。来自携带纯合子表面活性剂突变（SFTPB121ins2）的患者衍生的PSC的基于CRISPR的基因校正，恢复了AEC2中的表面活性剂处理。因此，PSC衍生的AEC2为疾病建模和未来远端肺的功能性再生提供了一个平台[10]。

综上所述，Nkx2-1基因在多种生物学过程中发挥着重要作用，包括甲状腺、肺和前脑的形态发生和分化，以及肺泡上皮细胞的形成。Nkx2-1的表达和功能受到多种因素的调控，包括lncRNA H19和NANCI等非编码RNA。Nkx2-1基因的突变与多种疾病相关，包括先天性甲状腺功能减退症、T细胞急性淋巴细胞白血病和肺腺癌。Nkx2-1基因的研究有助于深入理解其在正常发育和疾病发生中的作用机制，为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。