Tbx5-flox 基因敲除小鼠

Tbx5是T-box转录因子家族的一员，对心脏和前肢的发育起着至关重要的作用。在人类中，TBX5基因的显性突变会导致Holt-Oram综合征，这是一种遗传性疾病，其特征是上肢畸形和不同程度的心脏发育缺陷。动物模型也显示出类似的缺陷，为研究TBX5在胚胎发育中的作用提供了有用的平台。在心脏发育的早期阶段，TBX5似乎主要作为与心肌细胞成熟相关的基因的转录激活因子，以及分隔形态信号的上游。在心脏发育的后期阶段，TBX5对于心脏传导系统的模式化和成熟心肌细胞功能的维持至关重要[5]。

Tbx5在心脏发育中的重要性得到了进一步的证实，研究表明，TBX5的剂量直接影响了心脏形态发生和基因表达的异常程度。使用小鼠基因系列，发现TBX5剂量与异常心脏形态发生和基因表达的严重程度之间存在敏感的负相关。携带TBX5低效等位基因的小鼠（Tbx5(lox/+)小鼠）中的CHDs不如Tbx5杂合子小鼠（Tbx5(del/+))中的CHDs明显，而纯合子低效（Tbx5(lox/lox))胚胎的心脏发育明显比TBX5阴性（Tbx5(del/del))胚胎更为先进。对整个基因系列中目标基因表达的分析揭示了TBX5剂量范围内非常精细的敏感性，其中一些基因对TBX5 mRNA水平的15%的差异反应明显不同。这一分析扩展到全基因组水平，揭示了一个TBX5剂量敏感的遗传程序，涉及心脏转录因子网络、发育中的重要细胞间信号分子和离子通道蛋白。这些结果表明，发育中的心脏对TBX5剂量的变化非常敏感，并为CHDs中转录和细胞机制的破坏提供了重要的见解[4]。

Tbx5在心脏发育中的作用机制也得到了深入研究。Tbx5通过维持前心场特异性增强子网络来维持心房的身份。通过在心房工作心肌中特异性敲除（KO）转录因子TBX5，可以评估其对心房身份的需求。心房TBX5失活下调了心房心肌细胞（aCM）选择性基因的表达。使用并发单核转录组学和开放染色质分析，确定了对照和TBX5 KO aCM之间的基因组可及性差异，揭示了69%的对照富集的ATAC区域被TBX5结合。与这些区域相关的基因在KO aCMs中下调，表明它们作为TBX5依赖性增强子起作用。通过比较增强子染色质环使用H3K27ac HiChIP确定了510个对TBX5剂量敏感的染色质环，其中74.8%的对照富集环在对照富集的ATAC区域含有锚点。这些数据共同表明，TBX5通过结合并保持心房增强子的组织特异性染色质结构来维持心房基因表达程序[2]。

此外，TBX5还通过调节Aldh1a2的表达来调节一个RA-Hedgehog-Wnt基因调控网络，从而协调心肺（CP）发育。TBX5直接维持前肠外侧板中aldh1a2的表达，Aldh1a2是RA合酶，通过一个进化上保守的内含子增强子。TBX5促进后第二心场身份，在RA的正反馈循环中，与Fgf8-Cyp调节模块抗衡，以限制FGF活性到前部。研究发现，TBX5/Aldh1a2依赖的RA信号直接通过一个保守的MACS1增强子激活邻近前肠内胚层中的shh转录。Hedgehog信号与TBX5在间充质中协调，激活wnt2/2b的表达，从而在肠前内胚层中诱导肺命运。这些结果为心脏和肺发育之间的相互关系提供了机制上的见解，从而为CP进化与出生缺陷提供了信息[1]。

DNA甲基化水平也与TBX5基因启动子有关。在墨西哥儿科患者中，TBX5基因启动子的DNA甲基化水平与先天性室间隔缺损有关。在35例患有先天性室间隔缺损的患者和48例对照中，使用焦磷酸测序分析评估了TBX5基因启动子中六个CpG位点的DNA甲基化水平。患有先天性室间隔缺损的个体的平均甲基化水平高于对照组（p < 0.004）。在五个CpG位点，还发现患者的甲基化水平高于对照组（p < 0.05）。高甲基化水平与先天性室间隔缺损相关（OR = 3.91; 95% CI = 1.02-14.8; p = 0.045）。ROC分析表明，TBX5基因的甲基化水平可以用来作为先天性室间隔缺损的风险标志（AUC = 0.68，95% CI = 0.56-0.80; p = 0.004）。最后，环境因素分析表明，母体感染增加了先天性室间隔缺损的风险（OR = 2.90; 95% CI = 1.01-8.33; p = 0.048）。这些数据表明，TBX5基因的高DNA甲基化可能与先天性室间隔缺损有关[3]。

综上所述，TBX5是一个关键的转录因子，对心脏和前肢的发育起着至关重要的作用。TBX5的突变会导致Holt-Oram综合征，这是一种遗传性疾病，其特征是上肢畸形和不同程度的心脏发育缺陷。TBX5通过维持前心场特异性增强子网络来维持心房的身份，并通过调节Aldh1a2的表达来调节一个RA-Hedgehog-Wnt基因调控网络，从而协调心肺（CP）发育。DNA甲基化水平也与TBX5基因启动子有关，可能与先天性室间隔缺损有关。因此，TBX5的研究对于理解心脏发育的分子机制以及预防和治疗心脏疾病具有重要意义。