Plaa-flox 基因敲除小鼠

Plaa，即Phospholipase A2-Activating-Protein，是一个编码磷脂酶A2激活蛋白的基因，参与膜蛋白的转运。Plaa基因通过其PUL结构域（PLAP、Ufd3p和Lub1p）与p97/VCP相互作用，从而调节突触囊泡的再循环。已有研究发现，一些家族中携带双等位PLAA变异体，导致进行性神经变性，但单等位PLAA变异体的后果尚未阐明。通过外显子组或全基因组测序，研究人员在患有神经发育障碍（NDDs）的儿童中发现了影响PUL结构域保守残基的PLAA错义变异体，包括精神运动发育迟滞、智力障碍（ID）和自闭症谱系障碍（ASDs）。对这些变异体的计算机和体外研究揭示了C末端链排列异常和PLAA-p97/VCP相互作用减少的现象。这些发现扩展了与PLAA相关的神经疾病相关的等位基因和表型异质性，突出了异常囊泡再循环作为由于PLAA基因遗传缺陷导致的NDDs的潜在疾病机制[1]。

Lysosomes作为关键的信号枢纽，负责调控关键的酶复合物。LGALS蛋白（LGALS3、LGALS8和LGALS9）是内质膜损伤反应的重要组成部分。如果ESCRT无法修复损伤，则LGALS介导的泛素化会发生，招募自噬受体（CALCOCO2、TRIM16和SQSTM1）以及包含UBXN6、PLAA和YOD1的VCP/p97复合物，从而启动选择性自噬。通过生物发生进行的溶酶体补充受到TFEB的调节。LGALS3与TFRC和TRIM16相互作用，有助于ESCRT介导的修复和自噬介导的损伤溶酶体的清除。LGALS8抑制MTOR并激活TFEB，以转录ATG和溶酶体基因。LGALS9抑制USP9X，激活PRKAA2、MAP3K7、泛素化和自噬。ATG8与单个膜的结合（CASM）启动由ATP6V1A、ATG16L1、ATG12、ATG5、ATG3和TECPR1介导的损伤修复。ATG8ylation或CASM激活了MERIT系统（ESCRT介导的修复、自噬介导的清除、MCOLN1激活、Ca2+释放、RRAG-GTPase调节、MTOR调节、TFEB激活和GTPase IRGM激活）。Annexins ANAX1和ANAX2有助于损伤修复。应激颗粒稳定受损的膜，招募FLCN-FNIP1/2、G3BP1和NUFIP1以抑制MTOR并激活TFEB。溶酶体协调对内质膜损伤的协同反应，对先天性和适应性免疫至关重要。未来的研究应该揭示ATG蛋白、LGALSs、TRIMs、自噬受体和溶酶体蛋白在溶酶体损伤反应中的协同作用[2]。

在真菌Aspergillus nidulans中，plaA基因编码一种含有细胞质磷脂酶A(2)（cPLA(2)）基序的蛋白。plaA的翻译产物是一个837个氨基酸的蛋白，包含在大多数哺乳动物cPLA(2)同源物中存在的保守的脂酶区域。Northern印迹分析显示，在葡萄糖-乳糖培养基中，plaA的高表达。plaA的缺失突变体与野生型菌株相似，但PLA(2)活性降低。在酵母细胞中表达plaA的N端截短形式导致Ca2+依赖性PLA(2)活性增加，与以(14)C标记的磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）为底物的载体转化细胞相比[3]。

Legionella pneumophila通过其II型分泌系统分泌磷脂酶A活性，这些活性具有某些磷脂的特异性。在这项研究中，研究人员鉴定和表征了plaA基因，该基因编码一种从溶血磷脂中裂解脂肪酸的磷脂酶A。plaA基因编码一个309个氨基酸的蛋白（PlaA），该蛋白与含有催化特征GDSL的脂解酶组具有同源性。在大肠杆菌中，克隆的基因赋予了对溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰甘油的水解作用，这种水解作用对胰蛋白酶具有抗性。通过等位交换产生了L.pneumophila plaA突变体。尽管突变体在标准缓冲酵母提取物肉汤中生长正常，但其培养上清液中释放脂肪酸的能力丧失了80%以上，这表明PlaA是L.pneumophila的主要分泌溶血磷脂酶A。突变体的降低的脂解活性通过在蛋黄琼脂上生长和薄层色谱得到证实，并且可以通过重新引入完整的plaA拷贝来补充。PlaA的过表达完全保护了L.pneumophila免受溶血磷脂酰胆碱的毒性作用，这表明PlaA在细菌对溶血磷脂的解毒作用中发挥作用。plaA突变体在U937细胞巨噬细胞和Hartmannella vermiformis变形虫中生长与野生型相似，表明PlaA不是L.pneumophila细胞内感染所必需的。在表征plaA的过程中，研究人员发现野生型军团菌分泌磷脂胆固醇酰基转移酶活性，突出了L.pneumophila产生的脂解酶的谱系[4]。

通过外显子组或全基因组测序，研究人员在患有神经发育障碍（NDDs）的儿童中发现了影响PUL结构域保守残基的PLAA错义变异体，包括精神运动发育迟滞、智力障碍（ID）和自闭症谱系障碍（ASDs）。对这些变异体的计算机和体外研究揭示了C末端链排列异常和PLAA-p97/VCP相互作用减少的现象。这些发现扩展了与PLAA相关的神经疾病相关的等位基因和表型异质性，突出了异常囊泡再循环作为由于PLAA基因遗传缺陷导致的NDDs的潜在疾病机制[5]。

PlaA是一种新型信号分子，调节花生四烯酸的产生并参与炎症反应。在当前研究中，研究人员揭示了PLAA的产生是由化疗药物顺铂在HeLa宫颈癌细胞中诱导的。为了确定顺铂诱导的PLAA表达的可能促凋亡作用，研究人员使用了HeLa（Tet-off）细胞，这些细胞过度表达plaa基因（plaa（high）），并将其与对照（plaa（low））细胞进行比较，后者从染色体中产生内源性plaa。顺铂刺激的plaa（high）细胞中DNA片段化、caspase 3、8和9活性、PLA(2)酶活性和细胞色素c从线粒体中渗漏的水平显著高于顺铂刺激的plaa（low）细胞。重要的是，针对PLAA的siRNA（siRNA-PLAA）降低了顺铂诱导的PLAA、DNA片段化和PLA(2)活化的水平，同时促进了plaa（high）和plaa（low）细胞的细胞活力。顺铂诱导的plaa（high）细胞中细胞色素c的渗漏由siRNA-PLAA降低，并且通过添加外源性花生四烯酸（AA）得到恢复，这表明顺铂诱导的PLAA促进了细胞色素c的渗漏/线粒体损伤，部分是通过积累AA。此外，顺铂刺激的plaa（high）细胞产生的细胞保护性簇蛋白少于顺铂刺激的plaa（low）细胞，而siRNA-PLAA促进了plaa（high）和plaa（low）细胞中的簇蛋白产生。研究人员证明，簇蛋白降低了顺铂刺激的plaa（high）和plaa（low）细胞中的DNA片段化，这与簇蛋白促进癌症化疗耐药性的观点一致。此外，顺铂刺激的plaa（high）细胞产生的IL-32（一种促凋亡蛋白）多于顺铂刺激的plaa（low）细胞，而siRNA-PLAA降低了plaa（high）和plaa（low）细胞中的IL-32产生。最后，蛋白质组学分析显示，顺铂刺激的plaa（high）细胞中磷酸化的JNK/c-Jun和FasL的水平高于以相同方式处理的plaa（low）细胞。总之，数据表明，PLAA诱导通过四种途径增强了顺铂诱导的细胞凋亡，即通过1）积累AA和线粒体损伤，2）下调细胞保护性簇蛋白，3）上调促凋亡IL-32，以及4）诱导JNK/c-Jun信号通路和FasL表达[6]。

plaA基因编码Prevotella loescheii的一种半乳糖苷特异性粘附素，该基因包含一个程序化移码跳跃。移码区域由两个UAA终止密码子、两个在终止密码子之间的四个相同碱基的重复和一个位于第二个UAA下游的茎环结构组成，该结构具有形成假结的潜力。茎环和假结是许多逆转录病毒中发现的特征，在这些病毒中，移码是一种更常见的现象。终止密码子、序列重复和二级结构在P.loescheii plaA基因及其mRNA转录本中都被鉴定出来。在lacZ基因的9和10密码子之间融合整个plaA移码区域的框内融合允许在大肠杆菌中相对高效地表达（为对照的4%至25%）β-半乳糖苷酶[7]。

Magnaporthe oryzae已被用作研究植物-真菌相互作用分子基础的模型真菌病原体，因为它具有经济和遗传重要性。在这项研究中，研究人员鉴定了一个新型基因Moplaa，它是人类PLAA的直系同源物，编码磷脂酶A(2)-激活蛋白。通过多序列比对分析发现，Moplaa在一些真核生物中是保守的。使用基因靶向替换方法研究了Moplaa基因的功能。Moplaa缺失突变体表现出生长迟缓、分生孢子萌发减少、分生孢子产生减少、附着器渗透压降低和对水稻CO-39的致病性降低。重新引入基因恢复了Moplaa缺失突变体的缺陷[8]。

PLAA是一种新型信号分子，调节前列腺素（PGE(2)）和肿瘤坏死因子（TNF）-α的产生。为了在原位表征PLAA的功能，研究人员生成了HeLa（Tet-off）细胞，这些细胞过度表达plaa（plaa（high）），以及对照（plaa（low））细胞，后者中的plaa基因以相反的方向构建。与plaa（low）细胞相比，plaa（high）细胞在TNF-α的刺激下产生显著更多的PGE(2)和IL-6。与相应的plaa（low）细胞相比，TNF-α诱导的plaa（high）细胞中胞质PLA(2)、环氧化酶-2和NF-κB的激活和/或表达增加。plaa（high）细胞的微阵列分析随后进行功能测定，发现与plaa（low）细胞相比，促炎细胞因子IL-32的产生增加，而annexin A4和簇蛋白的产生减少。研究人员证明了annexin A4作为PLA(2)的抑制剂的作用，并表明添加外源性簇蛋白限制了plaa（high）细胞中PGE(2)的产生。为了了解plaa基因表达的调节，研究人员在HeLa细胞中使用荧光素酶报告系统，并确定了plaa基因外显子1中的一个刺激元件，具有Sp1结合位点，以及一个抑制元件。通过使用针对Sp1的诱饵DNA寡核苷酸和竞争结合测定，研究人员表明Sp1维持plaa基因的基础表达并绑定到上述刺激元件。研究人员首次证明，TNF-α诱导的内源性PLAA可以增强PLA(2)和NF-κB的激活，从而持续炎症[9]。

Legionella pneumophila编码一种称为PlaA的胞外分泌磷脂酶A，该酶通过II型分泌系统转运。它在L.pneumophila发病机制中维持Legionella包含的囊泡的完整性中起着至关重要的作用。在这里，研究人员表明PlaA具有主要溶血磷脂酶活性，以水解溶血磷脂中的脂肪酸酰基。尽管它对催化磷脂中脂肪酸酰基的水解具有非常低的磷脂酶A活性，但PlaA可以与磷脂酰胆碱（PC）等磷脂结合，其解离常数为11.1μM。序列比对分析与活性测定相结合表明，PlaA在磷脂酶A家族已知结构的已知结构中包含一个独特的底物结合位点，这表明PlaA可能呈现一个新颖的底物识别机制。通过在296K的悬挂滴中进行蒸汽扩散，纯化和结晶了天然PlaA及其硒代蛋氨酸（SeMet）取代形式。对于天然PlaA蛋白，衍射数据收集到2.0Å的分辨率，对于SeMet取代的PlaA蛋白，收集到2.7Å的分辨率。天然PlaA晶体属于单斜晶系P21空间群，而SeMet取代的PlaA晶体属于原始正交晶系P212121空间群。从SeMet SAD数据集中获得了PlaA的初始相位[10]。

综上所述，PLAA是一种重要的信号分子，参与调节膜蛋白的转运、突触囊泡的再循环、溶酶体损伤反应和炎症反应。PLAA的变异体与神经发育障碍和神经变性相关。PLAA的过度表达可以增强顺铂诱导的细胞凋亡，并参与炎症反应的调节。PLAA在多种生物学过程中发挥作用，包括细胞分化、发育、代谢和疾病发生。PLAA的研究有助于深入理解PLAA的生物学功能和疾病发生机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。