Otx2-flox 基因敲除小鼠

Otx2，即正交同源框2基因，编码一种对脑、小脑、松果体和眼睛的正常发育至关重要的转录因子。Otx2在视网膜中从早期胚胎发生到成年都发挥着关键作用。一旦视泡形成，该基因对于视网膜色素上皮的特异性至关重要。Otx2也是感光细胞发生和分化的关键调节因子，并在出生后对于双极细胞终末成熟至关重要。Otx2的表达在分化的视网膜中得以维持，在该基因对于外视网膜的维持至关重要。在视觉皮层中，该基因通过旁分泌机制调节神经元可塑性。人类OTX2杂合突变与严重的眼部畸形相关，这些畸形伴随大脑异常和垂体功能障碍。最近的研究还确立了OTX2基因作为髓母细胞瘤的致癌基因，这是一种起源于小脑的恶性脑肿瘤[1]。

Otx2基因突变导致一个女性RPGR突变携带者出现更严重的视网膜表型。在这项研究中，描述了一个家系，其中一个半合子的男性表现出典型的显性表型，三个杂合子的女性表现出典型的携带者表型。一个第四个杂合子的女性表现出明显严重的视网膜表型，并且携带OTX2基因的独立致病突变，以及相关的系统性表型。该研究假设，OTX2突变与家族性视网膜色素变性GTP酶调节基因变体相结合，导致比该家系中其他杂合子女性所见的更严重的眼部表型，这是由于OTX2介导的感光细胞保护丧失[2]。

成年小鼠视网膜中Otx2基因的缺失导致快速RPE萎缩和缓慢感光细胞退化。在成年小鼠中，Otx2在视网膜中强烈表达。人类该基因的突变与严重的眼部畸形和视网膜疾病相关。因此，探索其在发育后的功能很重要。在成熟的视网膜中，Otx2在三种细胞类型中表达：属于神经视网膜的感光细胞和双极细胞，以及与感光细胞形成紧密相互依赖的功能单元的相邻结构视网膜色素上皮（RPE）。条件性自敲除被用于研究成年小鼠中Otx2基因的晚期功能。这种策略基于在Otx2位点结合一个敲入CreERT2等位基因和一个打孔等位基因。时间控制注射他莫昔芬仅在Otx2表达细胞中激活重组酶，导致在其整个表达域中选择性敲除该基因。在成年视网膜中，Otx2蛋白的丧失导致感光细胞的缓慢退化。相比之下，RPE活性的剧烈变化迅速发生，这可能是感光细胞疾病的主要原因。新的小鼠模型揭示了成年视网膜中Otx2的新功能。研究表明，这种转录因子对于长期维持感光细胞至关重要，这可能是通过控制RPE的特定活动实现的[3]。

OTX2基因通过调节mTORC2信号通路在小脑髓母细胞瘤中诱导肿瘤生长并触发软脑膜转移。髓母细胞瘤（MB）包括不同的亚组，软脑膜疾病/转移（LMD）在相关的死亡中起着重要作用。尽管广泛探索了MB中的经典基因，但LMD的分子机制以及正交同源框2（OTX2）基因的参与，该基因是侵袭性MB组3的关键驱动因子，仍然理解不足。鉴于OTX2的关键作用，我们研究了其作为侵袭性细胞行为的催化剂的潜力，包括迁移、侵袭和转移。OTX2过表达增强了MB组3细胞中的细胞生长、运动性和极化。在过表达OTX2的细胞中，小鼠的正位植入导致中位生存期缩短，并伴随脊髓和脑转移的发展。机制上，OTX2作为机械靶标雷帕霉素（mTOR）基因启动子和mTORC2信号通路的转录激活因子，与上调的下游基因相关，这些基因协调细胞运动和迁移。mTOR mRNA的敲低减轻了OTX2介导的细胞运动性和极化增强。对人MB肿瘤样本（N = 952）的分析显示，OTX2和mTOR mRNA表达之间存在正相关，突出了OTX2在mTORC2通路中的临床意义。我们的结果表明，OTX2控制mTORC2信号通路，在小脑髓母细胞瘤组3中引发LMD，并通过mTORC2抑制提供了潜在的疗法途径[4]。

特定阶段的OTX2调控网络和成熟相关基因程序是RPE神经能力固有的障碍。视网膜色素上皮（RPE）在脊椎动物中表现出广泛的可塑性，并且是再生视网膜神经元的潜在细胞来源。胚胎羊膜动物具有通过FGF依赖性方式通过重新编程RPE细胞来再生神经视网膜的短暂能力。鸡RPE可以在胚胎第4天（E4）时再生神经视网膜，但RPE神经能力在胚胎第5天（E5）时丧失。为了确定导致再生能力丧失的机制，使用E4和E5鸡RPE，以及在接受视网膜切除术和FGF2处理后这两个阶段的RNA和ATAC测序。发现与神经视网膜命运相关的基因在非再生的E5 RPE中仍然可被FGF2诱导。与命运限制同时发生的，RPE细胞稳定地退出细胞周期，并降低在再生过程中通常表达的细胞周期进展基因的表达，包括E2F1。E5 RPE在没有视网膜切除术或FGF2治疗的情况下，独立地激活与成熟功能相关的基因通路，包括视网膜代谢、色素合成和离子运输。此外，E5 RPE无法有效地在FGF2的响应下抑制OTX2的表达。预测的OTX2结合基序在E5 RPE中经历可及性的增加，其中许多与已知促进RPE分化和成熟的基因的假定调控元件相吻合。总的来说，这些结果揭示了基因调控的广泛变化，导致RPE神经能力的丧失，并将OTX2作为巩固RPE命运的关键决定因素。这些结果为了解RPE谱系在早期发育过程中的限制提供了宝贵的见解，并将有助于理解在脊椎动物中观察到的RPE衍生视网膜再生的不同能力[5]。

Otx2同源框基因控制视网膜感光细胞命运和小脑发育。使用小鼠的条件性基因敲除，表明转录因子Otx2对于视网膜感光细胞命运决定和小脑发育至关重要。Otx2缺乏将分化的感光细胞转化为无长突细胞样的神经元，并导致松果体中松果体细胞的完全缺乏。还发现Otx2激活视杆细胞-视锥细胞同源框基因Crx，该基因对于感光细胞的终末分化和维持至关重要。此外，逆转录病毒基因转移的Otx2引导视网膜祖细胞成为感光细胞。因此，Otx2是视网膜感光细胞命运决定的关键调节基因。结果表明，感光细胞命运决定和小脑细胞发育的关键分子步骤[6]。

Otx2同源框基因的基因剂量对于雄性小鼠的生育力至关重要。下丘脑、垂体和性腺共同指导哺乳动物生殖功能的发育和调节。促性腺激素释放激素（GnRH）表达仅限于约800个神经元，这些神经元起源于嗅觉原基，然后迁移到下丘脑。下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的协调依赖于GnRH神经元在发育过程中的正确迁移进入下丘脑，随后是GnRH的适当合成和脉冲式分泌。这些过程中的任何缺陷都会导致不育。Otx2是果蝇正交同源框的脊椎动物同源物，是一种转录因子，已被证明对于正常的大脑和眼睛发育至关重要，并且在发育中的GnRH神经元和垂体中表达，表明该基因可能在HPG轴的发育中起关键作用。由于Otx2-null小鼠是胚胎致死的，因此分析了杂合子Otx2小鼠的生殖能力，以确定Otx2基因剂量对正常HPG轴功能的贡献。数据表明，Otx2的正确剂量对于正常的生育力至关重要，因为丢失一个Otx2等位基因导致雄性小鼠出现明显的生殖表型，这是由于发育过程中GnRH神经元迁移的破坏[7]。

OTX2介导的替代剪接维持了组3髓母细胞瘤干细胞程序。OTX2是一种转录因子，是髓母细胞瘤（MB）的已知驱动因子，在肿瘤的子集中扩增，并在大多数组3和组4 MB中过表达。在这里，我们展示了OTX2在组3 MB替代剪接中的非典型作用。OTX2通过蛋白质-蛋白质相互作用与剪接调节因子复合物的大组装相关联，并调节干细胞剪接程序。OTX2可以直接或间接结合RNA，这可能部分独立于其DNA调节功能。OTX2控制一种促肿瘤形成的剪接程序，该程序在人小脑菱唇起源中得到体现。在OTX2调节的差异性剪接基因中，PPHLN1在小脑菱唇最原始的干细胞中表达，并且靶向PPHLN1剪接可减少肿瘤生长并增强体内生存率。这些发现确定了OTX2介导的替代剪接作为驱动组3 MB进展的细胞命运决定的主要决定因素[8]。

OTX1和OTX2基因在髓母细胞瘤中的表达。为了研究OTX1和OTX2基因在60个髓母细胞瘤标本样本中的表达情况，并建立基因表达与临床和病理学特征之间的相关性。对60名在圣保罗大学医学院附属克拉克纳斯医院和巴雷托斯癌症医院诊断为髓母细胞瘤的患者进行了回顾性分析。创建了一个包含60名患者的数据库，包含OTX1和OTX2基因表达的信息（使用实时聚合酶链反应获得）和临床和流行病学数据。进行了统计分析以验证临床病理学数据和随访方面与基因表达之间潜在的相关性。OTX1基因在研究人群中的表达率为52%。表达与年龄（成人中更高）、位置（主要在半球）和病理类型（促纤维增生）相关。OTX2基因在研究人群中的表达率为62%。表达与年龄（年轻年龄组中更高）、位置（主要在蚓部）和病理类型（经典和间变性）相关。观察到OTX2基因表达与髓母细胞瘤软脑膜转移的发展之间存在统计学相关性。OTX1和OTX2的相对表达取决于患者年龄、肿瘤位置和病理变异。此外，OTX2表达可能是髓母细胞瘤软脑膜转移的预测因子。OTX通路应被视为髓母细胞瘤发展的一个重要途径[9]。

类似饮酒的乙醇摄入增加成年小鼠腹侧被盖区Otx2、Wnt1和Mdk基因的表达。酒精使用障碍与多巴胺能系统的病理生理学变化相关。正交同源框2（OTX2）是一种转录因子，对于腹侧被盖区（VTA）中多巴胺能神经元的发育至关重要，VTA是大脑中参与药物强化的关键区域。先前的研究表明，胚胎发育过程中的乙醇暴露会降低中枢神经系统中的Otx2 mRNA水平。我们假设，OTX2的水平会受到成年动物类似饮酒的乙醇消费的影响。为了测试这一点，通过定量实时PCR和蛋白质印迹分别测量了小鼠VTA中Otx2 mRNA和蛋白水平，在小鼠在黑暗中饮酒的程序中饮用乙醇4天，该程序诱发类似饮酒的乙醇消费（在黑暗中饮酒）。还测量了乙醇饮酒后VTA中已知和假设的OTX2转录靶基因（Sema3c、Wnt1和Mdk）的表达。在第四个饮酒会话后的24小时内，VTA中Otx2 mRNA和蛋白水平升高，并且Mdk转录本的表达相应增加。有趣的是，Wnt1转录本在第四个饮酒会话后立即在VTA中升高，但24小时后恢复到对照水平。接下来研究了病毒介导的VTA中Otx2的减少是否会改变乙醇或蔗糖摄入。将表达靶向Otx2的shRNA或对照shRNA的慢病毒载体注入VTA，并使用黑暗中饮酒方案对小鼠进行乙醇和蔗糖摄入测试。降低VTA中OTX2的水平不会改变乙醇或蔗糖消耗。尽管VTA中的OTX2可能不参与成年小鼠中类似饮酒的饮酒，但OTX2可能有助于该区域中乙醇引起的转录变化[10]。

综上所述，Otx2是一种关键的转录因子，对于大脑、小脑、松果体和眼睛的正常发育至关重要。它在视网膜中发挥关键作用，从早期胚胎发生到成年都发挥着重要作用。OTX2的突变与严重的眼部畸形和视网膜疾病相关，使其成为研究的热点。此外，OTX2还与髓母细胞瘤的发生和进展相关，使其成为治疗该疾病的一个重要靶点。未来的研究可以进一步探索OTX2在视网膜再生、神经退行性疾病和癌症中的潜在作用，为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。