Neurod1-flox 基因敲除小鼠

Neurod1，也称为神经元分化因子1，是一种重要的转录因子，参与调节神经系统的发育和功能。Neurod1属于Neurod家族，该家族还包括Neurod2和Neurod6等其他成员。Neurod1在神经发生过程中起着关键作用，特别是在神经元分化和成熟的过程中。

在成年哺乳动物大脑中，神经再生的能力在很大程度上丧失，除了少数几个特定的区域。然而，通过Neurod1介导的细胞重编程技术，可以恢复神经系统的功能。例如，研究发现，使用Neurod1腺相关病毒（AAV）基因疗法可以在缺血性损伤后再生大量功能性新神经元。在研究中，通过Neurod1 AAV基因疗法，成功再生了由缺血性损伤造成的总神经元损失的三分之一，并同时保护了另外三分之一受伤的神经元，导致了显著的神经恢复。RNA测序和免疫染色证实了细胞转化后的神经元恢复，不仅在mRNA水平上，而且在蛋白质水平上也得到了证实。脑切片记录显示，在Neurod1表达2个月后，由星形胶质细胞转化而来的神经元表现出强大的动作电位和突触反应。顺行和逆行追踪揭示了星形胶质细胞转化神经元向其目标区域的远距离轴突投射的时间依赖性。行为分析表明，在细胞转化后，运动和认知功能都有显著的改善。这些结果表明，通过Neurod1基因疗法实现的原位细胞转化技术可以再生大量功能性新神经元，以恢复损伤后的神经元功能[1]。

此外，Neurod1还可以调节内皮基因表达，以调节AAV-PHP.eB的传递和缺血性卒中后的恢复进程。研究发现，在正常脑组织中，AAV-PHP.eB-GFP对照病毒可以有效地穿过血脑屏障并感染脑细胞。然而，在卒中后，AAV-PHP.eB-GFP对照病毒在血管中高度受限。令人惊讶的是，在切换到治疗性载体AAV-PHP.eB-NeuroD1-GFP后，病毒载体成功穿越了血管并感染了脑细胞。使用Tie2-cre转基因小鼠，研究人员证明了Neurod1调节内皮基因表达以调节AAV-PHP.eB传递。随着内皮细胞中信号通路的改变，Neurod1有效地保护了血脑屏障的完整性，减弱了神经炎症，抑制了神经元凋亡，并在缺血性卒中后挽救了运动缺陷。此外，在脑细胞中过表达Neurod1进一步促进了神经再生。这些结果表明，使用AAV-PHP.eB进行静脉基因治疗缺血性卒中与颅内基因治疗不同，并且使用AAV-PHP.eB进行Neurod1静脉输注有效地挽救了血管损伤和神经元损失，为中风提供了一种先进的治疗方法[2]。

在肺神经内分泌肿瘤中，ASCL1和Neurod1发挥着重要的调控作用。研究发现，ASCL1和Neurod1在SCLC中发挥着不同的作用。ASCL1存在于小鼠肺神经内分泌细胞中，并且在SCLC小鼠模型中对于肿瘤形成是必需的。ASCL1靶向致癌基因，包括MYCL1、RET、SOX2和NFIB，而Neurod1靶向MYC。ASCL1和Neurod1调节不同的基因，这些基因通常与神经元功能有关。ASCL1还调节NOTCH通路中的多个基因，包括DLL3。因此，ASCL1和Neurod1在SCLC中区分了异质性，具有不同的基因组景观和不同的基因表达程序[3]。

Neurod1还可以直接将小鼠小胶质细胞重编程为神经元。研究发现，外源性Neurod1最初占据了与双价组蛋白H3赖氨酸4（H3K4me3）和H3K27me3标记相关的封闭染色质区域，以诱导神经元基因表达。这些区域在重编程的后期阶段被解析为单价的H3K4me3标记，以建立神经元的身份。此外，转录抑制因子Scrt1和Meis2作为Neurod1的靶基因被诱导，导致小胶质细胞基因的表达减少。同时，小胶质细胞的表观遗传特征在启动子和增强子区域被消除。这些发现揭示了Neurod1的先驱活性伴随着全球表观遗传重塑，为两个连续事件的发生提供了基础：神经元特性获得的开端和小胶质细胞身份的丧失[4]。

在胰腺癌中，基因组分析发现了32个反复突变的基因，这些基因聚集在10个途径中：KRAS、TGF-β、WNT、NOTCH、ROBO/SLIT信号传导、G1/S转换、SWI-SNF、染色质修饰、DNA修复和RNA处理。表达分析定义了4个亚型：鳞状细胞、胰腺祖细胞、免疫原性和异常分化内分泌外分泌（ADEX），这些亚型与组织病理学特征相关。鳞状细胞肿瘤富含TP53和KDM6A突变，上调TP63∆N转录网络，胰腺内胚层细胞命运决定基因的过度甲基化，并且预后较差。胰腺祖细胞肿瘤优先表达早期胰腺发育相关的基因（FOXA2/3、PDX1和MNX1）。ADEX肿瘤显示出上调的基因，这些基因调节与KRAS激活、外分泌（NR5A2和RBPJL）和内分泌分化（NEUROD1和NKX2-2）相关的网络。免疫原性肿瘤含有上调的免疫网络，包括与获得性免疫抑制相关的途径。这些数据推断出胰腺癌亚型的分子进化差异，并为治疗开发提供了机会[5]。

MYC驱动SCLC亚型的动态演化，通过重编程神经内分泌命运。研究发现，MYC在神经内分泌细胞中激活Notch，使肿瘤细胞去分化，促进SCLC从ASCL1+到NEUROD1+再到YAP1+状态的动态转变。MYC还从不同的细胞类型中促进POU2F3+肿瘤。人类SCLC表现出肿瘤内亚型异质性，表明这种动态演化发生在患者肿瘤中。这些发现表明，遗传学、细胞起源和肿瘤细胞可塑性决定了SCLC亚型[6]。

MafA、Neurod1和HNF1β协同激活Slc2a2（Glut2）基因在β细胞中。研究发现，进化保守区域（ECR）位于Slc2a2转录起始位点下游约40 kbp，在MIN6 β细胞系中作为活性增强子发挥作用。此外，还发现三个β细胞富集的转录因子MafA、Neurod1和HNF1β通过3'下游远端增强子（ECR3'）和基因的近端启动子区域协同激活转录。数据还表明，HNF1β同时结合到其目标位点内的启动子和ECR3'对于转录激活是必不可少的，而MafA和Neurod1结合到其各自的目标位点内的ECR3'增强了转录。共免疫沉淀实验表明，MafA、Neurod1和HNF1β相互作用。总的来说，这些结果表明，通过MafA、Neurod1和HNF1β的启动子增强子通信对于Slc2a2基因表达至关重要。这些发现为阐明β细胞中Slc2a2基因表达的调控机制提供了线索[7]。

在体内使用谱系追踪重新审视星形胶质细胞到神经元的转化。研究发现，假设的星形胶质细胞转化神经元实际上是内源性神经元。AAV介导的NEUROD1和报告基因的共表达可以特异性和有效地诱导报告标记的神经元。然而，这些神经元不能通过谱系映射策略追溯回静息或反应性星形胶质细胞。相反，通过逆行标记方法，结果揭示了内源性神经元是这些病毒报告标记神经元的来源。类似地，尽管在体内有效地敲低了PTBP1，但通过谱系追踪的常驻星形胶质细胞并没有被转化为神经元。这些结果表明，谱系追踪策略对于研究体内细胞命运转化至关重要[8]。

Neurod1介导的星形胶质细胞到神经元的转化的转录组分析。研究发现，Neurod1过表达后，星形胶质细胞基因（ACTG1、ALDH1A3、EMP1、CLDN6、SOX21）显著下调，而神经元基因（DCX、RBFOX3/NeuN、CUX2、RELN、SNAP25）显著上调。Neurod家族成员（Neurod1/2/6）和信号通路（Wnt、MAPK、cAMP）以及神经递质受体（乙酰胆碱、生长抑素、多巴胺）也显著上调。基因共表达分析确定了Neurod1相互作用网络中的许多中心基因，包括CABP7、KIAA1456、SSTR2、GADD45G、LRRTM2和INSM1。与化学转化相比，研究发现Neurod1作为强大的驱动因素，在星形胶质细胞到神经元的转化过程中触发了快速的转录组变化。因此，这项研究揭示了Neurod1的许多重要下游靶点，如HES6、BHLHE22、INSM1、CHRNA1/3、CABP7和SSTR2，它们可能在星形胶质细胞到神经元转录组景观转变过程中发挥关键作用[9]。

KDM6A表观遗传地调节SCLC中的亚型可塑性。研究发现，KDM6A失活诱导了从ASCL1到NEUROD1的亚型可塑性，导致SCLC肿瘤同时表达ASCL1和NEUROD1。机制上，KDM6A通常维持一个有利于ASCL1亚型的活性染色质状态，其丧失导致神经内分泌基因增强子上的H3K4me1减少和H3K27me3增加，导致细胞状态倾向于ASCL1到NEUROD1亚型转变。这项工作确定了KDM6A作为控制ASCL1到NEUROD1亚型可塑性的表观遗传调节因子，并提供了一个自发的SCLC遗传工程小鼠模型，以模拟ASCL1和NEUROD1亚型的异质性和可塑性，这些亚型在35-40%的人类SCLC中存在[10]。

综上所述，Neurod1在神经系统的发育和功能中发挥着重要作用。Neurod1介导的细胞重编程技术可以恢复神经系统的功能，特别是在缺血性损伤后。此外，Neurod1还可以调节内皮基因表达，以调节AAV-PHP.eB的传递和缺血性卒中后的恢复进程。在肺神经内分泌肿瘤和胰腺癌中，Neurod1也发挥着重要的调控作用。因此，Neurod1的研究对于深入理解神经系统的发育和功能、神经再生以及相关疾病的治疗具有重要意义。