Nat3-flox 基因敲除小鼠

Nat3，全称为N-acetyltransferase 3，是一种存在于生物体内的酶，属于N-乙酰转移酶（NAT）家族。NAT家族的成员在生物体中发挥着重要的作用，催化许多重要的芳胺药物和前致癌物的生物转化。NAT可以解毒或激活前致癌物，这使其在增强或预防特定物质引起的毒性反应中可能发挥作用变得复杂。小鼠体内存在三种NAT同工酶：Nat1、Nat2和Nat3。Nat1和Nat2能够有效地乙酰化许多芳胺，而Nat3似乎只能代谢少数底物。

Sugamori等人的研究表明，Nat3(-/-)小鼠表现出正常的生存能力和繁殖能力。Nat3的表达在野生型动物中非常低，在Nat3(-/-)小鼠中完全检测不到。相比之下，在Nat1/2(-/-)小鼠中观察到Nat3转录本的表达显著增加。他们使用转录标记多态性方法确定Nat1/2(-/-)小鼠中Nat3表达的增加是由于在Nat1/Nat2基因区域插入磷甘油酸激酶-新霉素抗性盒，而不是生物学上的补偿机制。尽管Nat3转录本增加，但在Nat1/2(-/-)动物中，无论是体内还是体外，对p-氨基水杨酸盐、磺胺甲嘧啶、2-氨基芴和4-氨基联苯的N-乙酰化都检测不到。与此并行的是，在野生型和Nat3(-/-)小鼠之间，这些底物的体内清除或体外代谢没有观察到差异。因此，Nat3在野生型小鼠或缺乏Nat1和Nat2活性的小鼠中，不太可能在芳胺的N-乙酰化中发挥重要作用[1]。

Barker等人的研究对大鼠的Nat1、Nat2和Nat3 mRNA表达进行了定量分析。他们发现，在大鼠中，Nat1和Nat2的组织特异性表达在有限的范围内变化，Nat1大约有19倍的变化，Nat2大约有30倍的变化，两者在结肠中的表达最高。Nat3 mRNA的表达至少比Nat1或Nat2低2到3个数量级。比较雄性和雌性F344大鼠膀胱、结肠、肝脏和肺中的Nat1和Nat2 mRNA表达，未发现性别特异性差异。在从新生到成熟成年的Sprague-Dawley和F344大鼠中，结肠中的Nat2在出生后第一个月增加了10倍以上，这与Nat1的变化无关。相比之下，Nat2在Sprague-Dawley或F344大鼠的肝脏中没有表现出发育变化，而Nat1适度增加。这些大鼠Nat表达量的测量证实了Nat3的表达量很少，而Nat1和Nat2是所有测试组织中芳胺乙酰化活性的主要决定因素。这些发现展示了大鼠Nat1和Nat2基因的组织特异性和发育调节的差异，并有助于更全面地理解人类和其他物种的N-acetyltransferase基因在组织、性别和发育方面的表达模式[2]。

Kubiak等人的研究对炭疽杆菌中的外源性代谢酶进行了分子和功能分析，发现炭疽杆菌表达三种NAT同工酶，其中一种不活跃的NAT3同工酶具有非典型的Glu残基在其催化三联体中，并且其C-末端结构域被截断。研究结果表明，Nat3基因中鸟嘌呤580（G580）的缺失导致了截断的(BACAN)NAT3同工酶的表达。在Nat3基因中人工重新引入G580导致了一种功能性酶，能够乙酰化几种芳胺药物，其结构特征与其功能性的炭疽杆菌同系物((BACCR)NAT3)相似。对B. cereus群中nat3基因的进化分析进一步表明，nat3可能构成了B. anthracis物种的假基因。这些发现表明，具有不同特性和进化的NATs在炭疽杆菌中可能对其适应多样化的化学环境具有重要意义，对这些同工酶的更好理解对于其可能的药物靶点应用具有重要意义[3]。

Sugaya等人的研究显示，NatB乙酰转移酶在芽殖酵母中调节Rad51依赖的DNA双链断裂（DSB）修复。NatB是一个由Nat3和Mdm2组成的二聚体复合物。Nat3缺陷型细胞对DNA烷化剂甲基甲磺酸（MMS）敏感，而Rad51的过表达可以抑制nat3Δ细胞的MMS敏感性。Nat3缺陷型细胞具有更高水平的Rad52-yellow fluorescent protein foci，并且在从MMS暴露中释放后不能修复DSB。他们还发现，Nat3对于HR依赖的基因转换和基因靶向是必需的。重要的是，他们观察到nat3Δ突变部分抑制了srs2Δ细胞的MMS敏感性，并抑制了srs2Δ sgs1Δ细胞的合成疾病。因此，这些结果表明，NatB在Srs2之前发挥作用，激活Rad51依赖的HR途径以修复DSB[4]。

Fretland等人的研究克隆、测序和表达了来自C3H/HeJ（快速）和A/HeJ（慢速）乙酰化小鼠的NAT1、NAT2和NAT3基因，并对其功能进行了表征。他们发现，NAT1和NAT3的870 bp核苷酸编码区域在快速和慢速乙酰化小鼠品系之间没有差异，也与先前发表的小鼠NAT1和NAT3序列没有差异。然而，NAT2在快速和慢速乙酰化品系之间存在差异，其中A296 T的转换导致推断的氨基酸序列中的(Asn99-->Ile)置换。重组的NAT1、NAT2和NAT3蛋白催化N-、O-和N,O-乙酰转移酶活性。NAT3以非常低的速率催化芳胺的N-乙酰转移酶活性，这证实了先前的研究。N-乙酰化表观Km和Vmax动力学常数比重组小鼠NAT1低5-10倍。两种重组小鼠NAT1和NAT2催化芳胺致癌物的N-乙酰化固有清除率相似。两种重组小鼠NAT1和NAT2催化N-羟基芳胺(N-乙酰化)和N-羟基芳酰胺(N,O-乙酰化)致癌物的代谢活化。重组小鼠NAT3以非常低的速率催化N,O-乙酰化，而O-乙酰化则检测不到。快速和慢速乙酰化重组NAT2蛋白在通过O-或N,O-乙酰化激活芳胺、底物特异性、免疫反应蛋白表达、电泳迁移或N-乙酰转移酶Michaelis-Menten动力学常数方面没有差异。然而，慢速乙酰化重组NAT2蛋白的稳定性比快速乙酰化重组NAT2蛋白低10倍以上。这些研究表明，重组小鼠NAT1、NAT2和NAT3蛋白具有代谢活化和失活功能，并证实和扩展了小鼠乙酰化多态性的分子基础[5]。

Boukouvala等人的研究在大鼠中鉴定和表征了新的多态性与芳胺N-乙酰转移酶基因相关。他们从近交系（CBA和129/Ola）、远交系（PO和TO）和野生衍生近交系（Mus spretus和Mus musculus castaneus）小鼠品系中测序了Nat基因，并报告了M. spretus和M. m. castaneus的所有三个Nat基因中存在多态性，以及M. m. castaneus中Nat2和Nat3基因的多态性。使用肝脏匀浆的酶活性测定表明，M. m. castaneus是“快速”乙酰化剂，而M. spretus是“慢速”乙酰化剂。Western印迹分析表明，M. spretus肝脏中的NAT2蛋白比M. m. castaneus中的NAT2蛋白少。在哺乳动物细胞系中表达新的等位基因，并用一系列底物测定NAT酶活性。与M. spretus相比，M. m. castaneus的NAT1和NAT2同工酶表现出更高的乙酰化速率。NAT3等位基因的活性几乎检测不到，尽管通过RT-PCR在脾脏中检测到Nat3基因的转录。在BALB/c、C57Bl/6J、A/J、129/Ola、CBA、PO、TO、M. m. castaneus和M. spretus品系之间，四个与Nat基因紧密相关的微卫星重复序列中发现了新的多态性，可用于Nat相关的遗传学研究[6]。

Singer和Shaw的研究表明，Mdm20蛋白与Nat3蛋白一起乙酰化Tpm1蛋白，调节芽殖酵母中的肌动蛋白-肌动蛋白相互作用。Mdm20蛋白在芽殖酵母中肌动蛋白丝和肌动蛋白电缆的生成中起着重要作用，但它不是肌动蛋白丝或电缆的结构成分，其精确功能在电缆稳定性方面一直是个谜。他们的研究表明，缺乏Mdm20蛋白的细胞无法N-末端乙酰化Tpm1蛋白，而Tpm1蛋白是结合并稳定肌动蛋白丝和电缆的丰富的肌动蛋白形式。与乙酰化形式相比，未乙酰化的Tpm1蛋白的F-肌动蛋白结合活性严重降低。这些结果与最近的一项报告相补充，该报告指出Mdm20p与酵母中三种乙酰转移酶之一NatB复合物共纯化。他们提供了遗传学证据，表明Mdm20p与Nat3p（NatB乙酰转移酶的催化亚基）协同作用。这些结果强烈表明，Mdm20p依赖的Tpm1p的N-末端乙酰化是由NatB复合物介导的，这对于Tpm1p与肌动蛋白丝和电缆的结合和稳定是必需的[7]。

Walraven等人的研究鉴定和表征了功能性大鼠芳胺N-乙酰转移酶3，并将其与大鼠芳胺N-乙酰转移酶1和2进行了比较。他们发现，大鼠Nat3基因由一个单一的开放阅读框组成，编码290个氨基酸的蛋白质，类似于先前鉴定的人类和鼠源N-乙酰转移酶基因。大鼠Nat3核苷酸序列与人类NAT1和NAT2的序列分别有77.2%和75.9%的相同性。大鼠Nat3氨基酸序列与人类NAT1和NAT2的序列分别有68.6%和67.2%的相同性。大鼠Nat1、Nat2和Nat3均被克隆并在大肠杆菌中重组表达。重组大鼠Nat3表现出介于重组大鼠Nat1和Nat2之间的热稳定性。重组大鼠Nat3是功能性的，并催化了几个芳胺底物的N-乙酰化，包括3-乙基苯胺、3,5-二甲基苯胺、5-氨基水杨酸、4-氨基联苯、4,4'-亚甲基二苯胺、4,4'-亚甲基双(2-氯苯胺)和2-氨基芴，以及N-羟基-4-氨基联苯的O-乙酰化。芳胺致癌物如4-氨基联苯、N-羟基-4-氨基联苯和2-氨基芴通过重组大鼠Nat3的N-和O-乙酰化的相对亲和力与重组大鼠Nat1相似，并且高于重组大鼠Nat2。这是首次报道第三个具有显著功能能力的芳胺N-乙酰转移酶同工酶[8]。

Suzuki等人的研究表明，乳酸酸应激会导致芽殖酵母中的液泡碎裂，并损害细胞内氨基酸稳态。他们使用芽殖酵母基因删除集合，通过全基因组筛选来获得对4.0% l-乳酸（pH 2.8）的敏感性增加的基因。他们鉴定出107个基因，这些基因对酵母细胞适应乳酸酸应激的能力有显著贡献。在这次筛选中发现的基因中有超过30%是首次被鉴定出参与乳酸酸应激的适应机制。他们发现，由Uba4介导的蛋白质尿酰化和由Nat3介导的N-末端乙酰化参与了乳酸酸应激的适应机制。对基因的功能分类和显微镜分析揭示了乳酸酸应激适应机制中涉及的各种细胞功能，并表明与液泡转运相关的功能在乳酸酸应激适应机制中发挥着重要作用。他们还发现，在暴露于乳酸和盐酸应激后，液泡会立即碎裂。此外，他们的分析揭示了乳酸酸应激会显著降低细胞内氨基酸的含量。氨基酸补充恢复了酵母对乳酸酸的适应缺陷，这表明细胞内氨基酸稳态在乳酸酸应激适应机制中发挥着重要作用。这些数据表明，增强液泡完整性以及维持细胞内氨基酸稳态可能是提高对乳酸酸应激的抵抗力的有效方法[9]。

Alves等人的研究表明，N-末端乙酰化调节Bax靶向线粒体。促凋亡的Bax蛋白是线粒体通透性在凋亡过程中的主要效应物。Bax在多个水平上受到控制，包括翻译后修饰，如磷酸化和S-棕榈酰化。然而，关于其他蛋白质修饰对Bax活性的贡献知之甚少。他们使用酵母中异源表达的人Bax来研究yNaa20p（yNatB）对人Bax功能的N-末端乙酰化的影响。他们发现，人Bax被yNaa20p N-末端乙酰化，并且Bax的Nt-乙酰化对维持Bax在酵母和鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞质中的非活性构象是必需的。Bax在酵母naa20Δ和Naa25-/- MEF细胞中的线粒体中积累，但不会促进细胞色素c的释放，这表明需要额外的步骤才能完全激活Bax。总的来说，他们的结果表明，Bax的N-末端乙酰化参与其线粒体靶向[10]。

综上所述，Nat3是一种重要的N-乙酰转移酶，在多种生物过程中发挥着重要作用。Nat3的表达和功能在动物模型和人类疾病中表现出差异，这表明Nat3在疾病的发生和发展中可能发挥着重要作用。Nat3的研究有助于深入理解NATs的生物学功能和疾病发生机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。