Krtap13-flox 基因敲除小鼠

Krtap13基因属于角蛋白相关蛋白（KAP）家族，这个家族的蛋白是毛发和羊毛纤维的基本组成部分，并被认为是影响这些纤维性质的部分原因。KAPs可以细分为三个组：高硫（HS）KAPs、超硫（UHS）KAPs和高甘氨酸-酪氨酸（HGT）KAPs。Krtap13属于HGT-KAP家族，在人类中包含多个成员，而在羊中至今只发现一个成员。通过序列分析和系统发育比较，在中国藏羊中发现了三个Krtap13基因，可能分别代表KRTAP13-1、KRTAP13-2和KRTAP13-4，它们位于1号染色体上，在KRTAP15-1和KRTAP27-1之间，这种排列方式与人类相似但并不完全相同。在356只来自各种羊毛、肉用和双重用途品种的羊中，对每个基因进行了多个序列变异分析。在中国藏羊品种的240只羔羊中评估了这些基因对四个纤维性状的影响，包括平均纤维曲率（MFC）、平均纤维直径（MFD）、纤维直径变异系数（CVFD）和纤维直径标准差（FDSD）。研究发现，KRTAP13-2的一个等位基因与异质纤维的FDSD和CVFD降低有关。KRTAP13-4的变异与羊毛性状没有关联，而KRTAP13-1的关联分析没有进行，因为在研究的藏羊中没有发现这个基因的变异。这些发现表明KRTAP13-2在调节羊毛性状方面可能发挥作用，尤其是在较大异质纤维的纤维直径均匀性方面，并且建议将其作为改善羊毛性状的潜在标记[1]。

羊的KAP8-2基因是KAP8家族的一个新成员，在人类中不存在。KAP8是HGT-KAP家族，以前认为在人类和羊中都是由一个基因编码的。然而，最近在山羊中发现了一个KAP8-2基因，这促使研究者调查羊中是否存在这个基因。使用山羊KRTAP8-2的编码序列对羊基因组进行BLAST搜索，在羊染色体1上发现了一个同源区域。这个区域与之前已经确定的多个KAP基因聚类，包括（从着丝粒到端粒）KRTAP11-1、KRTAP7-1、KRTAP8-1、KRTAP6-2、KRTAP6-1、KRTAP13-3和KRTAP24-1。对假定基因的PCR-SSCP分析揭示了两种不同的PCR-SSCP条带模式，代表两种DNA序列。在TATA盒上游21 bp处发现了一个单核苷酸差异。这两种序列与已知的羊KRTAP序列没有很高的同源性，但与山羊和驯鹿的KRTAP8-2有很高的序列一致性。这些结果表明羊具有一个KAP8-2基因，并且这个基因是多态性的。假定的KAP8-2蛋白由63个氨基酸残基组成，富含甘氨酸和酪氨酸，但半胱氨酸含量较低。与其他HGT-KAPs相比，羊KAP8-2含有更多的酸性氨基酸残基，这可能导致其等电点（pI）较低，为6.3[2]。

在非典型甲状旁腺肿瘤（APT）的整个外显子组测序中，KRTAP13-3是突变频率最高的基因之一。APT是一种肿瘤，具有甲状旁腺癌（PC）的组织学特征，但缺乏局部浸润和/或远处转移，导致对其恶性潜能存在不确定性。为了阐明APT的分子景观和失调的通路，对16例APT进行了整个外显子组测序。肿瘤和匹配的外周血DNA使用Illumina HiSeq3000进行了WES。总共发现了192个非同义变异。蛋白质改变突变的平均数量为9。突变频率最高的基因包括BCOR、CLMN、EZH1、JAM2、KRTAP13-3、MUC16、MUC19和OR1S1。17个突变基因属于癌症基因目录列表。通过STRING网络分析识别的最一致的枢纽基因是ATM、COL4A5、EZH2、MED12、MEN1、MTOR、PI3、PIK3CA、PIK3CB和UBR5。失调的通路包括PI3 K/AKT/mTOR通路、Wnt信号通路和细胞外基质组织。在APT中发现了MEN1、CDC73、EZH2、PIK3CA和MTOR的变异，这些基因先前被报道为良性腺瘤（PA）和/或PC的已建立或假定/候选驱动基因。APT似乎没有特定的分子特征，但其基因组改变与PA和PC共享。CDC73的突变率较低，目前还不清楚这些突变是否与复发风险增加有关。该研究证实了PI3 K/AKT/mTOR和Wnt信号通路在甲状旁腺肿瘤发生中的关键作用，并揭示了关键表观遗传修饰基因（BCOR、KDM2A、MBD4和EZH2）中的突变，这些基因参与染色质重塑、DNA和组蛋白甲基化[3]。

在Graves病（GD）的新诊断患者中，KRTAP13-1是10个枢纽基因之一。这项研究使用了结合生物信息学方法来识别GD新诊断患者中的差异甲基化区域（DMRs）。从6名GD患者和对照组收集了外周血，并进行了甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）和NimbleGen人类DNA甲基化3×720 K启动子加CpG岛微阵列的进一步分析。DMRs被分为低甲基化基因和高甲基化基因，并映射到一个由数据集构建的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络中。然后，在由32名GD患者和30名对照组成的扩大人群中，使用亚硫酸氢盐扩增子测序对6个候选基因进行了验证。PPI分析揭示的前10个枢纽基因是CRHR1、CAMK2A、SERPINA1、RANBP9、ICAM1、ADRB2、KRTAP13-1、PTPRA、S100A2和KPRP。CDKN2C（51436061）、SERPINA1（94856657）、B3GNT2（62422532和62422689）和IRS4（107979477）的5个CpG位点被验证，GD患者和对照组之间的甲基化水平存在显著差异。根据性别分层，在女性GD患者和对照组之间检测到CDKN2C（51436061）、SERPINA1（94855831）和B3GNT2（62422301、62422327、62422356、62422365、62422374、62422532和62422689）的9个显著CpG位点。B3GNT2的62422532甲基化水平与血清TGAb和TRAb水平显著相关。B3GNT2的62422689甲基化水平与GD患者的年龄显著相关。在B3GNT2启动子区域特定CpG位点上预测转录因子结合的分析中，成对框蛋白5（Pax-5）和CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP β）可能分别受到CpG位点62422365和62422532甲基化的影响。CDKN2C、SERPINA1、IRS4，尤其是B3GNT2，是可能与GD相关的潜在异常甲基化基因。这些发现提供了GD疾病中DNA甲基化的最新信息[4]。

KRTAP13-3是用于预测细胞衰老状态的Epigenetic-Senescence-Signature中的6个CpG位点之一。追踪复制性衰老在细胞治疗中具有重要意义。细胞制备，如间充质干细胞（MSCs），在培养扩增过程中会经历连续的变化，这反映在增殖能力受损和分化潜能丧失上。这个过程与表观遗传修饰相关：在体外培养过程中，细胞在基因组中的特定位点获得与衰老相关的DNA甲基化（SA-DNAm）变化。研究者最近描述了一个Epigenetic-Senescence-Signature，通过分析6个CpG位点（与GRM7、CASR、PRAMEF2、SELP、CASP14和KRTAP13-3基因相关）的DNAm水平，可以预测细胞衰老状态，但这个Signature在后续传代和符合GMP条件的MSCs分离中的应用尚未得到证实。从人骨髓中分离MSCs，并在GMP条件下扩增至11个传代。基于每次传代时的细胞数量计算累积群体倍增（cPDs）和长期生长曲线。此外，对这些细胞制备的32个冷冻保存的份额进行了回顾性分析，使用了研究者们的Epigenetic-Senescence-Signature：在6个特定的CpG位点分析了DNAm水平，并使用这些结果来估计cPDs、培养扩增的时间和传代次数。总体而言，预测的参数和实际的参数显示出良好的相关性，特别是在cPDs方面。基于预测的cPDs，研究者们可以重建长期生长曲线，并在分子水平上证明复制性衰老的持续增加。基因组中特定CpG位点的表观遗传分析可用于估计细胞衰老状态，从而对治疗细胞产品的质量控制[5]。

在羊中，KRTAP13-1是纤维生长的候选基因之一。羊驼（Vicugna pacos）是秘鲁经济上重要且具有文化特色的物种。因此，关于控制感兴趣性状的基因的分子基因组信息，如纤维特性和颜色，对于改进育种和管理方案至关重要。目前对羊驼基因组的了解有限，特别是这些感兴趣基因的染色体定位落后于其他家畜物种。这项工作的主要目标是使用荧光原位杂交（FISH）将羊驼纤维生长和颜色的候选基因定位。研究者们报告了将纤维生长的候选基因COL1A1、CTNNB1、DAB2IP、KRT15、KRTAP13-1和TNFSF12定位到染色体16、17、4、16、1和16上。同样，研究者们报告了将纤维颜色的候选基因ALX3、NCOA6、SOX9、ZIC1和ZIC5定位到染色体9、19、16、1和14上。此外，由于KRT15在支架450（Vic.Pac 2.0.2）中与另外五个角蛋白基因（KRT31、KRT13、KRT9、KRT14和KRT16）簇生，整个基因簇被定位到染色体16。同样，将NCOA6定位到染色体19，使支架34与8个基因（Raly、EIF2S2、XPOTP1、ASIP、AHCY、ITCH、PIGU和GGT7）锚定到染色体19。这些结果与骆驼和人类、牛和猪之间已知的保守共线性块一致[6]。

在多疾病和没有健康对照的情况下进行全基因组关联测试时，KRTAP13-4是受AMD（年龄相关性黄斑变性）影响的基因之一。尽管可以进行大规模的全基因组测序，但高昂的成本迫使研究者们将注意力集中在疾病受试者上。因此，不同疾病的大规模测序数据集通常很容易获得，但没有健康对照与之对比。虽然可以使用只有疾病的样本进行关联研究，但这些关联可能是由作为对照的疾病驱动的，而不是研究的重点疾病。研究者们开发了一种基因型-表型反向回归，使用贝叶斯尖峰和平板先验，以实现在具有多种疾病的样本数据集上的关联测试。这种方法称为revreg，标记了由非重点疾病驱动的关联（包括常见和罕见变异）。基于模拟，revreg在3500个样本（共3500个样本）和14000个样本（共14000个样本）的情况下，对常见变异具有80%的功率来检测优势比1.74，对罕见变异具有3.73的功率，同时最小化I型错误。对于常见变异，研究者们在3657个全基因组测序样本上测试了这种方法，目的是发现与慢性阻塞性肺病（COPD）疾病风险相关的变异，使用三种其他疾病作为对照。研究者们证明了检测到六个高度显著的关联，可能与AMD相关。在一个包含8836个样本的外显子组数据集中，旨在表征与哮喘疾病风险相关的罕见变异，使用五种其他疾病作为对照，研究者们检测并删除了由于AMD（C3、CFH、CFHR5、CFI和DNMT3A）和RA（KRTAP13-4）而受影响的基因区域[7]。

在昌坦羊和穆扎法尔纳格里羊的比较皮肤转录组分析中，KRTAP13是纤维质量相关的基因之一。昌坦羊生活在拉达克的山区，以其细羊毛生产而闻名，并以灰皮肤和黑色或白色外套为特征。相比之下，来自北方平原的穆扎法尔纳格里羊产生粗羊毛，具有白色皮肤和外套。研究者们对每个品种的皮肤进行了比较全局基因表达分析。研究者们的分析确定了与穆扎法尔纳格里羊相比，昌坦羊中149个上调基因和2139个下调基因，p调整值（padj）≤0.05，Log2倍数变化≥1.5。上调基因的基因本体分析显示，与黑色素生物合成和发育色素沉着相关的术语丰富。此外，富集的KEGG通路包括酪氨酸代谢和代谢途径。在昌坦羊中表达更高的黑色素生成相关基因包括TYR、TYRP1、DCT、SLC45A2、PMEL、MLANA和OCA2。这些发现证实了黑色素在动物黑色外套和高原紫外线保护中的作用。此外，研究者们观察到与纤维质量相关的基因在拉达克的细羊毛生产羊中表达更突出，包括KRTAP6、KRTAP7、KRTAP13和KRTAP2。使用ACTB和PPIB作为参考基因，通过实时PCR在10个控制纤维质量和外套颜色的基因上验证了RNA测序结果。总之，昌坦羊和穆扎法尔纳格里羊的比较皮肤转录组分析揭示了与不同表型性状和环境适应性相关的基因差异，为潜在机制提供了有价值的见解[8]。

综上所述，Krtap13基因是KAP家族的重要成员，参与调节羊毛性状和纤维质量。在羊中，KRTAP13-2与纤维直径均匀性有关，而KRTAP13-4与羊毛性状没有关联。此外，KRTAP13基因在其他物种中也有重要作用，例如在羊驼中定位到特定染色体上，以及在多疾病关联研究中被标记。这些研究揭示了Krtap13基因在纤维生长和颜色方面的潜在作用，为羊毛生产和管理提供了新的见解。然而，需要进一步的研究来阐明Krtap13基因的生物学功能和在疾病发生中的作用。