Hes3-flox 基因敲除小鼠

Hes3，也称为Hairy and Enhancer of Split 3，是一种基本的螺旋-环-螺旋转录因子，主要在神经干细胞的发育过程中发挥作用，调节神经干细胞的更新。Hes3的表达和功能在多种生物学过程中具有重要意义，包括神经系统发育、细胞生长、胰岛素释放和癌症发生。

在神经系统的发育过程中，Hes3的表达对于维持神经干细胞的增殖和分化至关重要。Hes3的过度表达可以预测融合阳性横纹肌肉瘤患者的总体生存率降低，这是一种类似于未成熟和未分化骨骼肌的儿科癌症。然而，Hes3在融合阳性横纹肌肉瘤中的协同作用机制尚不清楚，可能与her3/HES3在神经发生中的作用有关。为了研究Hes3在发育过程中的功能，研究者们生成了斑马鱼her3的CRISPR/Cas9敲除突变体，her3是HES3的斑马鱼同源基因。her3敲除突变体胚胎表现出神经g1表达失调，神经g1是her3的靶基因，突变体her3无法结合神经g1启动子序列。此外，her3突变体胚胎的转录组分析表明，与器官发育相关的基因（如pctp和grinab）的表达显著下调。此外，her3敲除突变体胚胎中的差异表达基因富含Hox和Sox10基序。多种与癌症相关的基因通路受到影响，包括基质金属蛋白酶的抑制。总之，这个新的模型是一个强大的系统，用于研究her3/HES3介导的神经发育及其在癌症环境中的滥用[1]。

Hes3在成人的胰腺胰岛中也表达，并且调节基因表达、细胞生长和胰岛素释放。研究发现，Hes3在人和啮齿类动物的胰腺胰岛中表达。在鼠胰岛中，它与人胰岛α和β细胞标记物共定位。研究者使用小鼠胰岛素瘤细胞系MIN6进行了体外表征和功能研究，结果显示，在已知能够调节Hes3的条件下，细胞显示出Hes3表达和核定位升高，生长效率高，并且表现出更高的胰岛素释放反应。此外，它们对GLP-1类似物Exendin-4的药理学治疗有反应，Exendin-4增加了核Hes3的定位。研究者采用转染方法来探讨Hes3的具体功能。Hes3 RNA干扰抑制了细胞生长，并影响了基因表达，如DNA微阵列所示。Western印迹和PCR方法具体显示，Hes3 RNA干扰抑制了Pdx1和胰岛素的表达。Hes3过表达（使用Hes3-GFP融合构建体）证实了Hes3在调节Pdx1表达中的作用。Hes3 RNA干扰降低了胰岛素释放。缺乏Hes3的小鼠表现出由链脲佐菌素引起的胰岛损伤增加。这些数据表明，Hes3在胰腺胰岛功能中发挥作用[2]。

Hes3在成鼠脑中的表达在脱髓鞘和髓鞘再生的过程中受到调节。Hes3是STAT3-Ser/Hes3信号轴的组成部分，该信号轴控制神经干细胞和其他可塑性细胞的生长和存活。该通路药理学激活可促进缺血性中风和帕金森病模型中的神经元挽救和行为恢复。研究发现，Hes3在脱髓鞘/髓鞘再生模型中的表达在脱髓鞘峰值时降低，在撤除cuprizone后1周内部分恢复。这表明Hes3可能参与脱髓鞘/髓鞘再生。支持Hes3在维持少突胶质细胞标记中的作用，Hes3敲除小鼠在未受损的成鼠中，与野生型对照组相比，髓鞘碱性蛋白水平较低。研究者还提出了一种新的培养方法，用于培养已建立的少突胶质祖细胞系oli-neu，该方法可以维持Hes3的表达以及其自我更新和分化潜力，为研究Hes3提供了实验工具。基于这种方法，研究者发现Janus激酶抑制剂和dbcAMP是Hes3基因表达的有效诱导剂。研究者提供了一个新的生物标志物和细胞培养方法，这些方法可能在脱髓鞘/髓鞘再生研究中引起兴趣[3]。

Hes3通过上调Cyclin D1、Cyclin D3和MMP7的表达增强了肺癌的恶性表型。研究发现，Hes3在非小细胞肺癌组织中的表达显著高于正常肺组织。Hes3的表达与非小细胞肺癌组织中的低分化、晚期TNM分期、淋巴结转移和较短的病人存活时间显著相关。体外研究表明，在A549细胞中过表达Hes3可以显著促进癌细胞增殖和侵袭，而抑制Hes3的表达可以显著下调癌细胞的增殖和侵袭。Western印迹显示，在A549细胞中过表达Hes3可以显著上调Cyclin D1、Cyclin D3和MMP7的表达，而抑制Hes3的表达可以显著下调这些分子的表达。这些结果表明，Hes3可能通过调节Cyclin D1、Cyclin D3和MMP7，促进非小细胞肺癌的恶性表型，并可能成为一个有前景的癌症标志物[4]。

Hes3基因可以通过选择性启动子和外显子的利用产生结构和功能不同的因子。研究发现，小脑Hes3转录本（称为Hes3a）的5'-末端结构与胚胎Hes3（称为Hes3b）的5'-末端结构不同，两种类型的Hes3转录本来自不同的第一个外显子。Hes3a缺乏基本区域的氨基末端一半，因此不能结合DNA，而Hes3b包含完整的基本区域，并且像Hes家族的另一个成员Hes1一样，可以高亲和力地结合到N盒序列。两种类型的Hes3蛋白在功能上都与神经元决定因子Mash1拮抗，但只有Hes3b可以像Hes1一样抑制N盒含有启动子的转录。此外，在神经祖细胞中用逆转录病毒过表达Hes3b可以像Hes1一样抑制神经元分化，而Hes3a则不能。因此，在神经发育过程中选择性利用不同的启动子和第一个外显子，从单一的Hes3基因位点产生了结构和功能不同的蛋白质[5]。

Hes3在成人和人眼表面以及翼状胬肉中表达。研究者检查了神经干细胞生物标志物Hes3在眼前节和翼状胬肉异常生长情况下的存在。此外，研究者还研究了Hes3对辐射的反应。成鼠和人角膜巩膜连接和结膜，以及人翼状胬肉，用于免疫组织化学检测Hes3和其他标记。全身照射被用来研究Hes3表达模式的变化。成鼠和人眼睛以及翼状胬肉都含有表达Hes3的细胞群。在人眼中，Hes3阳性（Hes3+）细胞主要在结膜下空间分布，跨越角膜缘，它们与血管物理相关联。Hes3+细胞的细胞结构类似于在成鼠中枢神经系统中观察到的细胞结构。此外，照射减少了结膜下空间中Hes3+细胞的数量。相反，照射强烈促进了睫状体上皮细胞中Hes3的核定位。这些结果表明，最近发现的调节神经干细胞和胶质母细胞瘤癌症干细胞信号转导通路也在眼表、睫状体和翼状胬肉中起作用[6]。

MAMLD1基因的突变是男性外生殖器发育的致病基因。几乎10%的严重和非严重型尿道下裂患者表现出MAMLD1基因的突变。研究发现，MAMLD1基因的多态性与尿道下裂的遗传易感性相关。在150名尿道下裂患者和150名对照中，研究者发现p.P286S多态性在17/150名患者和12/150名对照中存在（11.3%对8.0%，p=0.32），p.N589S多态性在22/150名患者和12/150名对照中存在（14.6%对8.0%，p=0.068）。双重多态性（S-S单倍型）在16/150名患者和6/150名对照中存在（10.6%对4.0%，p=0.044，OR=2.87，95% CI为1.09-7.55）。相关性分析一致地揭示了所有三个计算机模型中结构预测或氨基酸可及性的改变。P286S、N589S和P286S+N589S蛋白质在Hes3启动子上的转激活活性没有降低。MAMLD1基因的多态性在尿道下裂患者中频繁存在。尽管在Hes3启动子上没有观察到转激活活性的改变，但计算机研究和S-S单倍型在尿道下裂患者中的显著增加发生率提出了这些变体赋予的特殊易感性的假设[7]。

Hes3通过干扰Wnt/β-catenin信号通路参与神经板边界形成。研究发现，hes3在非洲爪蟾发育过程中在胚胎外胚层中呈马蹄形域表达，位于发育中的神经板边缘。在早期神经胚阶段，hes3的错表达阻止了神经嵴（snai2、sox8、sox9和sox10）和颅咽管（six1和dmrta1）基因的表达，并促进了神经板（sox2和sox3）的命运。在尾芽阶段，这些胚胎表现出sox8和sox10表达的大幅上调，以及黑色素细胞分化相关基因（mitf和dct）的表达增加。使用激素诱导构建体，研究者表明，Hes3不会从头诱导色素细胞分化程序，而是将祖细胞维持在未分化状态，随着时间的推移，随着Hes3表达的减少，这些细胞采取色素细胞命运。研究者证明，机制上Hes3通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥作用，Wnt/β-catenin信号通路是神经嵴特化和色素细胞谱系分化的关键分子途径。研究者提出，Hes3在神经板的边缘空间限制了间充质衍生Wnt配体的反应，从而有助于在神经板边界建立基因表达的尖锐边界[8]。

PAX3-FOXO1转基因斑马鱼模型确定HES3为横纹肌肉瘤肿瘤发生的介质。研究者开发了一种由人PAX3-FOXO1驱动的斑马鱼肿瘤发生模型，并发现PAX3-FOXO1表现出离散的细胞谱系易感性和转化。肿瘤在1.6-19个月内发展，为原始神经外胚层肿瘤或横纹肌肉瘤。研究者利用这个PAX3-FOXO1转基因斑马鱼模型来研究PAX3-FOXO1如何利用早期发育途径进行致癌作用，发现her3是一个独特的靶点。过表达人her3同源物HES3抑制了斑马鱼和哺乳动物细胞中的肌生成，重现了横纹肌肉瘤的特征性肌肉发育停滞。在患者中，与融合阴性肿瘤相比，融合阳性肿瘤中HES3过表达。最后，在融合背景下，HES3过表达与患者存活率降低相关。研究者开发的新的斑马鱼横纹肌肉瘤模型确定了PAX3-FOXO1的一个新靶点，her3/HES3，它导致肌生成分化受损，并且在人类疾病中具有预后意义[9]。

Hes3在胚胎发育过程中的表达表明其在早期中脑-后脑模式形成中的作用。研究发现，在早期中枢神经系统发育过程中，Hes3在菱脑/后脑边界区域以及菱脑2、4、6和7中特异性表达。这种模式表明，Hes3可能作为一个分割基因发挥作用。在发育后期，Hes3与发育中的中枢神经系统中其他神经发生基因同源物共表达，并与经历间充质诱导的上皮细胞共表达[10]。

综上所述，Hes3是一个在多种生物学过程中发挥重要作用的转录因子，包括神经系统发育、细胞生长、胰岛素释放和癌症发生。Hes3在神经系统的发育过程中对于维持神经干细胞的增殖和分化至关重要，并且在成人的胰腺胰岛中也表达，调节基因表达、细胞生长和胰岛素释放。Hes3的表达和功能在多种生物学过程中具有重要意义，包括神经系统发育、细胞生长、胰岛素释放和癌症发生。