Gpr33-flox 基因敲除小鼠

Gpr33，也称为G蛋白偶联受体33，是一种属于趋化因子受体家族的孤儿受体。趋化因子受体主要控制白细胞的趋化作用和细胞间通讯，同时也与病原体入侵有关。Gpr33作为一种假基因，在大多数人类中不存在功能性的基因。在首次出现于哺乳动物基因组后，Gpr33在人类、其他类人猿和某些啮齿动物物种中独立地经历了假基因化。据推测，Gpr33失活的原因可能是其与一种特定于啮齿动物-类人猿的病原体的相互作用。在过去的100万年中，由于中性漂变导致的几个不相关物种的同时假基因化似乎非常不可能，这表明对Gpr33无效等位基因的选择。尽管人类Gpr33没有近期选择的特征，但与非洲和亚洲人群相比，欧洲人群中的假基因等位基因频率显著增加。由于其免疫系统中作用仍然是假设性的，表达分析表明，Gpr33在树突状细胞中高度表达。在细胞培养和体内，小鼠Gpr33的表达受Toll样受体（TLR）和AP-1/NF-kappaB信号通路的调节。我们的数据表明，Gpr33在先天免疫中发挥着重要作用，这在人类进化过程中变得不再重要，这很可能是因为过去或平衡选择[1]。

我们报道了一种新的编码一个假定的G蛋白偶联受体（GPCR）的人基因（GPR32）的克隆，该受体包含356个氨基酸，以及一个相关的假基因psi GPR32。GPR32的推断氨基酸序列与趋化因子受体家族成员的35-39%相同。psi GPR32与GPR32共享93%的核苷酸同源性。我们鉴定了一个编码一个假定的GPCR（GPR33）的小鼠EST，该GPCR包含309个氨基酸。GPR33的推断氨基酸序列与趋化因子受体家族成员的30-35%相同，并与GPR32编码的受体的36%相同。人类GPR33的直系同源物包含一个与小鼠相比的单个碱基对替换，导致在预测的第二胞内环中存在一个框内终止密码子，证明它是一个假基因。通过荧光原位杂交和YAC的物理作图，GPR32和psi GPR32都被定位到染色体19q13.3区域，而psi GPR33则被定位到染色体14q12[2]。

趋化因子和趋化因子受体是G蛋白偶联受体（GPCR）大家族的成员，它们控制白细胞趋化作用。除了它们的生理作用外，几种趋化因子和趋化因子受体，如CCR5和Duffy，已直接与病原体入侵有关。GPR33是一种孤儿趋化因子GPCR，之前在人类中被鉴定为假基因。GPR33在大约1.25-1.9亿年前的哺乳动物中进化。从18个真兽类目中的16个中克隆和分析的超过120个哺乳动物GPR33直系同源物表明，这种趋化因子GPCR不仅在人类，而且在一些大型类人猿和啮齿动物物种中也发生了失活。有趣的是，在所有类人猿和一些啮齿动物物种中发生失活的地方，样品中同时存在假基因和完整基因变体。对超过1200个代表所有主要语言群体的个体进行的分析表明，GPR33的完整等位基因仍然存在于人类群体中。人类等位基因的年龄估计表明，在过去100万年中发生了失活。同样，对超过120只野生灰鼠（Rattus norvegicus）的分析表明，gpr33的失活在全球范围内固定，并且发生在不到70万年前。几个不同哺乳动物目中的几个物种的同时失活及其固定表明，这种趋化因子受体基因存在选择压力[3]。

大多数视紫红质样G蛋白偶联受体家族的成员在其第三跨膜域的C端区域具有一个进化上保守的天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸（DRY）基序。DRY基序内残基的突变通常会使受体功能丧失，当它们自然发生时，甚至可以导致人类疾病。通过分析超过100个趋化因子受体GPR33的哺乳动物直系同源物，我们鉴定了DRY基序内的几个多态性和固定序列变异。出乎意料的是，小鼠GPR33中Arg（3.50）到His的自然发生突变在几个功能测试中没有与野生型受体显示出差异。对亚洲家鼠GPR33的序列分析揭示了野生捕获种群中Arg（3.50）和His（3.50）等位基因的多态性存在，进一步支持了两种等位基因的功能等价性。相比之下，仓鼠GPR33中发现的Arg（3.50）到Gly的突变使受体失活，并可能导致了该物种中该基因的假基因化。GPR33变体的功能数据表明，DRY突变具有不同的受体和背景特异性后果。我们的研究还揭示了GPR33作为假基因化过程中的错义突变的另一个例子。我们的研究还揭示了GPR33作为假基因化过程中的错义突变的另一个例子[4]。

化学随机诱变技术已与生殖细胞超突变剂N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）相结合，以提供全面的小鼠模型集合，这些模型随后在表型驱动的研究中被挖掘和分析。在这里，我们以高吞吐量的方式应用ENU诱变，以基因驱动的方式识别新的突变。大GPCR超家族的选定成员，黑皮质素3型（Mc3r）和4型（Mc4r）受体，以及孤儿趋化因子受体GPR33，被用作模型目标，以证明这种方法的可行性。对用ENU诱变的DNA和精液并行存档的筛选，以寻找这些GPCR中的突变，在体外受精之前，体外试验作为预选择步骤。例如，通过选择完全或部分失活的Mc4r突变，建立了遗传性肥胖小鼠模型。我们描述的技术有潜力在不到4个月内提供任何GPCR功能障碍的小鼠模型，并且可以扩展到其他感兴趣的基因类别[5]。

综上所述，Gpr33是一种属于趋化因子受体家族的孤儿受体，在人类和其他哺乳动物中发生了假基因化。尽管其功能尚不完全清楚，但研究表明Gpr33在免疫系统中发挥着重要作用，特别是在树突状细胞中高度表达。Gpr33的表达受TLR和AP-1/NF-kappaB信号通路的调节。此外，Gpr33的失活可能是由选择压力引起的，这表明它在进化过程中可能具有重要的生理功能。对Gpr33的研究有助于我们更好地理解趋化因子受体的功能和免疫系统的调控机制，为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。