Cryz-flox 基因敲除小鼠

Cryz，即zeta-crystallin，是一种在哺乳动物晶状体中高度表达的蛋白质，尤其在豚鼠和骆驼的晶状体中，它构成了大约10%的总可溶性蛋白。Cryz已被鉴定为一种新型的存在于多种哺乳动物组织中的醌氧化还原酶。人类Cryz基因（CRYZ）由九个外显子组成，跨度约20kb，其5'-侧翼区域富含G和C（58%），缺乏TATA和CAAT盒。豚鼠基因的分析揭示了存在两个不同的启动子，一个负责在豚鼠晶状体中的高表达，另一个负责在多种组织中酶水平的表达。与豚鼠基因的比较分析表明，一个大约2.5kb的区域，包括负责在豚鼠晶状体中高表达的启动子，在人类基因中不存在[1]。

CRYZ基因位于人类染色体1p22-p31区域。这一基因在豚鼠中与常染色体显性先天性白内障有关，因此被认为是人类先天性白内障的候选基因。通过分析17个人-鼠体细胞杂交的Southern板，以及荧光原位杂交技术，研究人员将CRYZ基因定位在1p22-p31区域。此外，通过分析10个无关联、无影响个体的DNA，发现了五个限制性片段长度多态性[2]。

Cryz作为一种后转录调节因子，通过结合Bcl-2 mRNA并增加其半衰期来调节Bcl-2基因表达。研究表明，通过使用乙酰水杨酸（ASA）调节Cryz蛋白活性，可以恢复A2780卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。分子对接和基于片段映射的方法揭示了ASA在Cryz蛋白中的潜在相互作用。在A375细胞中，证明了ASA能够抑制Cryz与Bcl-2和Bcl-xl mRNA靶标的结合活性。在A2780S和A2780R卵巢癌细胞中进行的细胞毒性试验显示，ASA处理或Cryz沉默能够逆转顺铂耐药性。ASA处理导致A2780S和A2780R细胞中Bcl-2和Bcl-xl mRNA水平的下调。这项研究证明了药理或遗传抑制Cryz能够恢复敏感或耐药卵巢癌细胞对顺铂的敏感性[3]。

Cryz是一种进化上受限的水溶性蛋白，它通过多种机制提供细胞保护以抵抗氧化应激。越来越多的证据表明，Cryz在肾脏中高度表达，在那里它作为一种转作用因子，增加谷氨酰胺分解代谢和钠/钾/氯共转运蛋白（BSC1/NKCC2）的表达，以帮助维持酸碱平衡和髓质高渗梯度。然而，Cryz在肾脏中的调节机制仍然在很大程度上未得到表征。研究表明，Cryz是法尼醇X受体（FXR）的直接靶点，FXR是一种对肾脏生理学重要的核受体。在原代培养的小鼠髓质集合管细胞（MCDs）中，FXR的激活和过表达显著上调了Cryz的表达。与siRNA介导的FXR敲低的小鼠MCD细胞相比，FXR诱导的Cryz表达几乎完全消失。此外，用FXR激动剂处理从全球和集合管特异性FXR缺陷小鼠中分离出的MCD细胞，未能诱导Cryz的表达。研究还发现，Cryz在小鼠肾脏中普遍表达，在髓质集合管细胞的细胞质中构成性表达。此外，Cryz在MCDs中的过表达显著减轻了高渗诱导的细胞死亡，可能是通过增加Bcl-2表达实现的。这些发现表明，Cryz在肾脏髓质集合管细胞中构成性表达，受FXR转录控制。鉴于FXR在MCDs中的重要作用，Cryz可能负责FXR在脱水期间高渗条件下对MCDs存活性的保护作用[4]。

Cryz基因与循环中抵抗素水平有关。通过对欧洲血统个体进行的全基因组关联（GWA）研究发现，CRYZ基因附近的遗传变异与抵抗素水平显著相关。研究还发现，这些遗传变异与2型糖尿病和心血管疾病的风险增加相关。这表明CRYZ基因可能参与了抵抗素水平的调节[5]。

CRYZ基因与白内障有关。晶状体蛋白被称为脊椎动物眼睛晶状体的主要结构蛋白，自100多年前被Mörner发现以来，主要的哺乳动物晶状体蛋白，即α-、β-和γ-晶状体蛋白，已根据其基因组织、表达模式的调节以及参与多种疾病进行了表征。近年来，在晶状体以外的地方也发现了越来越多的晶状体蛋白。进化分析表明，晶状体蛋白与参与对抗应激的蛋白有关。α-晶状体蛋白形成高达1Mio Da的大型复合物，由两个亚基组成，称为αA-和αB-晶状体蛋白。这些亚基由单个基因编码，Cryaa和Cryab位于不同的染色体上，是小热休克蛋白家族的成员。αA-晶状体蛋白被认为是分子伴侣。它主要在晶状体中表达，Cryaa基因的突变会导致隐性或显性白内障。相比之下，αB-晶状体蛋白的表达较为普遍；Cryab基因的突变与多种神经、心脏和肌肉疾病有关。β/γ-晶状体超家族由至少14个基因编码；这些蛋白具有四个希腊键结构。在哺乳动物中，这些基因不仅作为单个基因（Cryba1、Cryba2、Crygf、Crygs、CrygN）组织，还作为二聚体（Cryba4-Crybb1和Crybb2-Crybb3）和一个主要簇（Cryga-Cryge）组织。各种Cryb和Cryg基因被认为是通过各种希腊键编码单元的复制进化而来。这两个主要家族的区别在于，Cryb基因中的每个希腊键结构由一个外显子编码，而Cryg基因中的两个结构由一个单一的外显子编码。CrygN编码的中间体通过单独的外显子编码前两个希腊键结构，但其余的由一个单一的外显子编码。Cryb/Cryg基因的突变主要导致眼晶状体的混浊。在一些Cryg突变体中，已经证明形成包含变异γ-晶状体的大细胞核内淀粉样样细胞核内包涵体是白内障形成的关键事件。由Cryg突变引起的白内障形成还以二级晶状体纤维分化的停止为特征，如二级纤维细胞中细胞核残余的存在所表明，这些细胞核通常在二级纤维细胞中降解。此外，由于这些晶状体蛋白在眼外被发现，越来越多的临床特征正在被报道：βB2-晶状体（以前称为基本原理晶状体）也参与神经发生和男性不育。对于一些β/γ-晶状体，已经讨论了Ca2+结合特性；然而，这些晶状体是否在体内作为Ca2+储存库仍然是一个未解决的问题。酶晶状体是酶，已被募集到晶状体并在那里以高浓度表达。μ-和zeta-晶状体（基因符号：Crym和Cryz，分别）被讨论为哺乳动物的例子。人类CRYM基因的突变会导致非综合征性聋，而豚鼠Cryz基因的突变会导致白内障[6]。

CRYZ基因与肌萎缩侧索硬化症（ALS）有关。在一项针对中国汉族人群进行的两阶段全基因组关联研究中，发现了两个新的基因座与ALS有关。这些新基因座解释了总体疾病风险的2.2%。表达数量性状基因座搜索确定了TYW3/CRYZ和FGD4分别为1p31和12p11处的风险基因。这项研究确定了ALS的新易感基因。TYW3/CRYZ的发现支持了胰岛素抵抗可能参与ALS发病机制的观点[7]。

CRYZ基因与肿瘤抑制蛋白p53有关。研究表明，p53蛋白可以招募人Sin3B/HDAC1复合物下调其靶启动子，以应对基因毒性应激。根据细胞类型和DNA损伤的严重程度，p53蛋白介导细胞周期阻滞或凋亡，并激活DNA修复，这显然是通过调节其靶基因以及与其他蛋白质的直接相互作用实现的。p53已知通过多种机制抑制靶基因，其中之一是通过招募染色质重塑Sin3/HDAC1/2复合物。Sin3蛋白（Sin3A和Sin3B）通过作为核心Sin3/HDAC复合物组装的锚点来调节染色质水平的基因表达。Sin3/HDAC共阻遏复合物可以被大量DNA结合转录因子招募。Sin3A与p53密切相关，而Sin3B被认为是E2Fs的紧密相关蛋白。这项研究的主题是确定Sin3B在p53介导的基因抑制中的作用。研究表明，人p53和Sin3B（hSin3B）之间存在直接蛋白质-蛋白质相互作用。hSin3B蛋白的氨基酸1-399参与其与p53的N末端区域（氨基酸1-108）的相互作用。阿霉素处理引起的基因毒性应激增加了hSin3B的水平，hSin3B被招募到p53靶基因（HSPA8、MAD1和CRYZ）的启动子上。更重要的是，仅在p53(+/+)细胞系中观察到阿霉素处理后hSin3B的招募和对三个p53靶启动子的抑制。此外，在阿霉素处理后，观察到HSPA8和CRYZ启动子上H3K9残基的三甲基化增加。这项研究首次突出了Sin3B作为p53的重要相关蛋白，在介导细胞对应激的响应以及在转录抑制编码热休克蛋白或参与调节细胞周期和凋亡的蛋白的基因方面发挥着关键作用[8]。

Cryz在高原性肺动脉高压（HAPH）大鼠模型中发挥作用。研究表明，Selexipag、macitentan和reoxygenation可以防止平均肺动脉压力的增加和缺氧诱导的右心室肥厚，与vehicle相比。RNA-seq和蛋白质组学揭示了三种药物对HAPH的影响之间存在着强烈的关联，这三种药物几乎具有相同的效果。GO富集分析表明，差异表达基因包括那些参与代谢调节、转录和翻译的基因。各种分子通路被注释。Selexipag、macitentan和reoxygenation改善了HAPH。通过多组学筛选，Serpina1、Cryz和Cmc1被确定为与HAPH相关的关键基因[9]。

CRYZ基因与早期结直肠癌的预后生物标志物有关。研究表明，NNMT蛋白在癌症基质中表达水平不同，大约20%的癌症组织与正常结直肠黏膜相比过度表达NNMT。临床相关性分析显示，在早期癌症患者中，NNMT蛋白的过度表达与较短的总生存期和无病生存期显著相关，但在晚期结直肠癌中未发现这种相关性。TCGA和CPTAC结直肠癌队列的分析显示，NNMT mRNA表达与蛋白水平呈正相关，在CIMP高或MSI亚型中显著高于CIMP低或MSS亚型，并与INMT呈正相关，但与其相互作用伙伴如PNMT、ADK、APP、ATF6、BMF、BRD4、CDC37或CRYZ无相关性。在早期癌症中，NNMT表达在BRAF突变肿瘤中高于BRAF野生型肿瘤，但不受KRAS或PIK3CA突变状态的影响。作为一种在代谢和癌症表观遗传学中发挥重要作用的癌症基质蛋白，NNMT正在成为早期癌症风险分层的有希望的生物标志物[10]。

综上所述，CRYZ基因是一种在多种生物学过程中发挥重要作用的基因，包括晶状体形成、细胞保护、白内障、肿瘤抑制、肺动脉高压和结直肠癌。CRYZ基因的研究有助于深入理解晶状体蛋白的生物学功能和疾病发生机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。