Afp-flox 基因敲除小鼠

Alpha-fetoprotein (AFP) 是一种在哺乳动物胎儿血清中发现的蛋白质，主要由卵黄囊的胚外内胚层和胎儿的肝脏合成。出生后，AFP水平在血液中急剧下降，但在肝脏肿瘤和生殖细胞胚瘤中，AFP的合成会重新激活。在临床实践中，AFP血液水平的变化是肝脏肿瘤的一个重要标志，因此研究AFP的合成及其调节机制具有重要意义。

AFP基因的转录主要受转录水平的调节，AFP基因上游有一个7kb的调控区域，包括一个组织特异性启动子、三个独立的增强子和一个沉默子。一些普遍的和一些组织特异性的转录因子，包括肝细胞核因子（HNFs），它们介导了大多数肝脏特异性基因的转录，这些因子被发现可以与启动子结合。然而，决定AFP合成水平在个体发生和致癌过程中急剧变化的机制仍然不完全清楚。此外，关于AFP基因表达在非肝细胞来源的细胞和成年肝脏中的负性调节因子，人们所知甚少[4]。

在哺乳动物细胞中，AFP是研究发育基因调节的经典模型系统。据报道，肝脏中的ZBTB20是发育调节的，并在AFP出生后抑制中起核心作用。ZBTB20是AFP基因序列特异性的转录抑制因子。通过ELISA-based DNA-protein结合试验和常规凝胶迁移试验，成功鉴定了一个位于小鼠AFP基因-104/-86位置的ZBTB20结合位点，该位点被两个HNF1位点和两个C/EBP位点所包围。重要的是，该位点核心序列的突变完全消除了其在体外与ZBTB20的结合，以及ZBTB20对AFP启动子活性的抑制。这个独特的ZBTB20位点在大鼠和人类AFP基因中高度保守，但在白蛋白基因中不存在。这些发现有助于解释出生后肝脏中白蛋白和AFP基因的自主调节。此外，我们证明ZBTB20对AFP基因的转录抑制是肝脏特异性的。ZBTB20对肝脏以外的其他组织中AFP的沉默是不必要的[6]。

AFP基因的启动子区域在c.-200 C>T位点上有一个突变，该位点位于AFP肝细胞核因子1（HNF-1）的结合位点。所有携带突变的成员的AFP水平都高于4000 ng/L，但在该家族中排除了肝癌。然而，在绝经后妇女中发生了肝硬化。审查的病例表明，未知的超AFP与绝经后妇女肝硬化中的AFP的HNF-1结合位点密切相关（11/7），而HNF-1α和HNF-1β的血浆水平没有显著差异。AFP的HNF-1结合位点的突变可能导致AFP的异常高表达，通过改变HNF转录因子的结合，与绝经后妇女的肝硬化密切相关[5]。

AFP基因的表达在肝脏再生过程中受到Afr2基因的调节。C3H/HeJ小鼠的AFP基因表达水平比C57BL/6J小鼠高10倍。研究表明，急性二乙基亚硝胺（DEN）中毒后，AFP基因表达不受Afr2基因的调节。两种品系的AFP基因表达峰值水平相同，尽管在处理后的不同时间达到峰值。对不受Afr2调节的AFP衍生转座子的表达分析和遗传分析表明，DEN中毒后AFP基因表达峰值的时间差异独立于Afr2调节[2]。

为了构建一个携带AFP启动子和EGFP基因的重组腺病毒载体，以便在AFP产生的肝细胞癌（HCC）HepG2细胞中特异性表达EGFP基因。基于Adeno-X表达系统，从质粒pshuttle中移除了人类即刻早期巨细胞病毒启动子（PCMV IE），并用PCR合成的0.3 kb AFP启动子替换。增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因被插入到多克隆位点（MCS），然后构建了携带0.3 kb AFP启动子和EGFP基因的重组腺病毒载体。正常肝细胞系（LO2）、肝细胞癌细胞系（HepG2）和宫颈癌细胞系（HeLa）的细胞被腺病毒转染。Northern blot和荧光显微镜用于检测三种不同细胞系中EGFP基因在mRNA或蛋白质水平的表达。通过PCR从人类基因组中合成了0.3 kb AFP启动子。AFP启动子和EGFP基因被直接插入到质粒pshuttle中，并通过限制性内切酶消化和DNA测序得到证实。Northern blot显示，EGFP基因在HepG2细胞中明显转录，但在LO2和HeLa细胞中只有轻微的转录。此外，在荧光显微镜下，HepG2细胞中观察到了强烈的绿色荧光，但在LO2和HeLa细胞中荧光非常弱。在0.3 kb人类AFP启动子的控制下，携带EGFP基因的重组腺病毒载体可以在AFP产生的HepG2细胞中特异性表达。因此，这种腺病毒系统可以作为一种新型、强大且特异性的工具，用于AFP阳性原发性肝细胞癌的基因靶向治疗[1]。

为了研究基于肿瘤特异性自杀基因表达的肝细胞癌基因治疗，使用AFP增强子和管家基因启动子。本研究的目的是检验人类AFP增强子是否可以用于诱导HCC选择性表达单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因，该基因受磷酸甘油酸激酶（pgk）启动子的控制。将人类AFP增强子与非组织特异性的人类管家pgk启动子连接，构建了一个逆转录病毒载体。感染携带受AFP增强子/pgk启动子控制的HSV-tk基因的逆转录病毒的AFP产生HCC细胞，比那些感染相同逆转录病毒但不含AFP增强子的细胞对前药更昔洛韦（GCV）更为敏感。感染携带受AFP增强子/pgk启动子控制的HSV-tk基因的逆转录病毒的非HCC细胞，与那些感染相同逆转录病毒但不含AFP增强子的细胞相比，对GCV的抵抗力显著增强。Northern blot分析表明，AFP增强子导致AFP产生HCC细胞中HSV-tk表达的增强，并抑制非HCC细胞中的HSV-tk表达。结果表明，AFP增强子可以赋予pgk启动子HCC选择性，并且这种新型策略可能对HCC选择性癌症基因治疗有用[3]。

总之，AFP在肝脏肿瘤的发生和发展中起着重要作用。AFP基因的转录受到多种因素的调节，包括启动子区域的突变、转录因子和增强子。这些调节机制对于理解AFP的表达模式以及开发基于AFP的癌症治疗策略具有重要意义。未来的研究可以进一步探索AFP基因的调节机制，以及如何利用这些机制来改善肝脏肿瘤的治疗效果。