Guca1b-flox 基因敲除小鼠

Guca1b，也称为guanylate cyclase-activating protein 2 (GCAP2)，是一种钙结合蛋白。它通过激活Ret-GC1在光转导的恢复阶段发挥关键作用。Guca1b的基因突变与多种视网膜疾病相关，包括视网膜色素变性（RP）和锥形细胞变性。此外，Guca1b的表达与肠道功能密切相关，它是一种内源性配体，与肠道受体鸟苷酸环化酶-C (GC-C) 结合，刺激环状GMP的增加，并通过囊性纤维化跨膜传导调节器诱导氯分泌。

一项研究描述了小鼠uroguanylin基因（Guca1b）的克隆，并表明Guca1b与小鼠鸟苷素基因紧密连锁在染色体4上。这两个基因在结构上相似，都由三个短外显子组成；uroguanylin基因跨越2.4 kb，鸟苷素基因跨越1.7 kb。Uroguanylin mRNA主要在小肠近端表达，而鸟苷素mRNA主要在小肠远端和结肠表达。小鼠uroguanylin基因的上游启动子序列包含一个典型的TATA元件，位于转录起始位点，以及几个已知转录因子的结合位点，包括HNF-1和Sp1，这些位点位于前1 kb内。尽管uroguanylin和鸟苷素基因的结构和编码序列相似，但这两个基因在小肠中的5'侧翼序列和表达模式是不同的。Uroguanylin和鸟苷素可能代表了基因复制的产物，它们已经进化，以允许在小肠中具有重叠和互补的表达模式[1]。

另一项研究发现，血液白细胞DNA甲基化水平与未来心肌梗死和冠状动脉心脏病的风险相关。这些CpGs映射到在钙调节中起关键作用的基因（ATP2B2、CASR、GUCA1B、HPCAL1），以及在其他研究中发现的与血清钙（CASR）、血清钙相关的CHD风险（CASR）、冠状动脉钙化斑块（PTPRN2）和肾脏功能（CDH23、HPCAL1）相关的基因。这些发现表明，血液DNA甲基化与未来CHD的风险相关，并可能作为深入了解CHD发展的有价值的工具[2]。

在另一项研究中，研究者调查了编码guanylate-cyclase激活蛋白2（GCAP2）的基因（也称为GUCA1B基因）中的突变，这些突变发生在患有视网膜色素变性的日本患者中。研究者通过单链构象多态性分析和直接测序对63名患有常染色体显性视网膜色素变性（ADRP）的无亲缘关系患者的基因组DNA样本进行了筛选。研究者在三个独立家庭的三个索引患者中鉴定了一个新的过渡突变，该突变将157位密码子的GGA转换为AGA。对这三个家庭的七个成员的表型检查发现，这个突变与五个成员的视网膜色素变性相关，其中一些成员还伴有黄斑受累，一个成员患有黄斑变性，而一个成员则表现出无症状的正常表型。此外，研究者还鉴定了以前未知的基因多态性变化，包括V29V、Y57Y、T87I和L180L。研究者的发现表明，GCAP2基因的突变可以导致一种常染色体显性视网膜营养不良，具有不同的表型表达和未完全外显[3]。

在另一项研究中，研究者对患有常染色体显性锥形细胞和锥形细胞-杆状细胞营养不良的患者的GUCA1B基因进行了突变筛查。研究者对24名根据标准诊断标准诊断为锥形细胞营养不良或锥形细胞-杆状细胞营养不良的未亲缘关系患者进行了研究，这些患者的家族史与常染色体显性遗传模式一致。研究者对所有编码外显子的GUCA1B基因进行了突变分析，方法是通过聚合酶链反应扩增基因组DNA，然后进行DNA测序。研究者发现了三种不同的序列变异，包括c.-17T>C、c.171T>C和c.465G>T。序列变异c.465G>T编码一个保守的氨基酸替换，p.Glu155Asp，位于GCAP2蛋白的EF手4钙结合位点。所有序列变异都先前在健康受试者中被报道。在所选患者组中未发现明显的致病性突变，这表明GUCA1B基因在欧洲或北美人群中是视网膜退行性变性的次要原因[4]。

在一项研究中，研究者使用生物信息学方法识别了与糖尿病视网膜病变相关的中心基因，并揭示了其分子机制。研究者使用了GEO数据集GSE60436。在筛选出差异表达基因（DEGs）后，研究者进行了基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能富集分析。随后，研究者使用Search Tool for Retrieval of Interacting Genes (STRING)数据库构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并使用Cytoscape软件进行了可视化。最终，研究者通过cytoHubba插件确定了10个中心基因。共鉴定出592个DEGs，包括203个上调基因和389个下调基因。DEGs主要富集在视觉感知、感光细胞外段膜、视网膜结合和PI3K-Akt信号通路。通过构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，最终确定了10个中心基因，包括CNGA1、PDE6G、RHO、ABCA4、PDE6A、PDE6B、NRL、RPE65、GUCA1B和AIPL1。CNGA1、PDE6G、RHO、ABCA4、PDE6A、PDE6B、NRL、RPE65、GUCA1B和AIPL1可能是DR的潜在生物标志物和治疗靶点[5]。

在一项研究中，研究者对四个常染色体显性视网膜营养不良的意大利家庭进行了临床和遗传学特征描述。37名家庭成员接受了详细的眼科检查，包括视力测定、眼底检查、视网膜电图和眼电图。研究者进行了全基因组扫描，并对连锁区域内的三个候选基因进行了直接测序。19人患有锥形细胞-杆状细胞营养不良，4人患有锥形细胞营养不良，而另一名患者则被诊断为中央区域性脉络膜营养不良。全基因组扫描将疾病位点定位到染色体6，区域p12.2-p21.1，最大LOD得分为6.71。对受影响个体的关键重组体的分析将位点定位到一个由新产生的标记6-41025和6-52969标记的12-Mb区域。假设完全外显，两个健康个体的重组体定义了一个更小的关键区域，该区域在标记6-42153和D6S459之间，大小为3.7 Mb。连锁区间内的三个基因（RDS、GUCA1A和GUCA1B）被认为是很好的候选者，因为它们参与了不同的视网膜营养不良形式。然而，对这些基因的突变分析未能发现病原性突变。研究者获得的显著的LOD得分以及RDS、GUCA1A和GUCA1B基因中缺乏突变支持了这样一个观点：在染色体6簇内存在一个新的、尚未确定的基因，该基因负责视网膜营养不良[6]。

在一项研究中，研究者对400名患有常染色体显性中央和周围视网膜营养不良的无亲缘关系受试者的GCAP2基因进行了遗传分析。研究者观察到一些涉及内含子和编码序列的变化。在内含子1中观察到T到C的核苷酸变化，但酪氨酸残基57保持不变。在内含子3中观察到1 bp内含子插入、一个G到A的单核苷酸替换，以及155位密码子的GAG到GAT变化。后者导致谷氨酸到天冬氨酸的保守变化。在内含子4中观察到7 bp内含子插入、一个A到G的单核苷酸替换，以及内含子3'的单碱基对变化C到G。这些变化都不会影响该基因的正确剪接。所有这些变化都在对照中观察到。研究结果表明，目前没有证据表明GCAP2参与了这些患者常染色体显性视网膜退行性变性的发病机制。所有检测到的新变化都被发现是序列变异或等位基因，而不是疾病引起的[7]。

在一项研究中，研究者对视网膜疾病中鸟苷酸环化酶及其相关激活蛋白进行了研究。两种鸟苷酸环化酶同型，GC1和GC2，分别由GUCY2D和GUCY2F编码，负责在光暴露后补充光感受器中的cGMP。两者都对光感受器敏感性和恢复的正常动力学至关重要，尽管疾病突变仅限于GUCY2D。GUCY2D基因的隐性突变导致严重的早发性致盲疾病Leber先天性黑蒙症，而显性突变导致较晚发病的轻度锥形细胞-杆状细胞营养不良。环化酶活性受Ca(2+)的调节，Ca(2+)与GC相关蛋白GCAP1和GCAP2结合，这些蛋白分别由GUCA1A和GUCA1B编码。尚未报道在这两个基因中存在隐性突变。显性错义突变主要局限于蛋白的Ca(2+)-结合EF手中。与GUCY2D显性突变导致疾病机制相似，这些突变通常会改变环化酶对抑制的敏感性，因为在光闪光后Ca(2+)水平升高[8]。

在一项研究中，研究者探索了GCAP2在调节光反应中的作用。研究者破坏了编码GCAP2的基因GUCA1B，并测试了敲除型杆状细胞调节RetGC和产生光反应的能力。敲除并没有损害杆状细胞的活力或改变外段超微结构。RetGC1、RetGC2和GCAP-1的表达水平没有发生补偿性变化，但GCAP2的缺失以两种方式影响了鸟苷酸环化酶活性；（a）在低[Ca(2+)]时，cGMP合成的最大速率降低了2倍；（b）cGMP合成的半最大速率在高于正常的[Ca(2+)]时达到。添加针对小鼠GCAP2的抗体会对野生型视网膜中的鸟苷酸环化酶活性产生类似的影响。与正常杆状细胞相比，GCAP2敲除型杆状细胞的光响应恢复得更慢。敲除型杆状细胞对闪光和照明步骤更敏感，但与正常杆状细胞相比，在较低的强度下倾向于饱和。因此，GCAP2对鸟苷酸环化酶活性的调节加快了闪光和步骤响应的恢复，并调整了杆状细胞对较高环境照度的工作范围[9]。

在一项研究中，研究者对Mfrprd6突变小鼠眼睛的基因进行了分析，揭示了Prss56、视觉循环和光转导mRNA的差异性积累。Mfrprd6突变导致视网膜和RPE中的转录和蛋白质水平发生显著变化。Mfrprd6眼睛中，与视网膜退行性变性相关的基因转录本水平显著下降，包括参与视觉循环（Rpe65、Lrat、Rgr）、光转导（Pde6a、Guca1b、Rgs9）和感光细胞盘形态发生（Rpgrip1和Fscn2）的基因。RPE65水平显著降低2.0倍。Prss56转录本水平在Mfrprd6眼睛中增加了17倍。通过qRT-PCR验证，发现在P7、P14和P21时，Prss56转录本相对于对照分别增加了3.5倍、14倍和70倍。这种趋势在其他RPE或感光细胞突变小鼠模型中并未观察到，这些模型具有相似的疾病进展。Prss56和Glul原位杂交直接确定了内层核层中的Müller胶质细胞为Prss56的表达细胞类型。总之，Mfrprd6等位基因导致视网膜和RPE中的转录和蛋白质水平发生显著的产后变化。Mfrp缺陷与Prss56上调之间的联系，以及人类MFRP或PRSS56变异与眼轴大小的遗传相关性，表明这些基因是影响产后后眼发育的调节网络的一部分[10]。

综上所述，Guca1b是一种重要的钙结合蛋白，在光转导的恢复阶段发挥关键作用。Guca1b基因突变与多种视网膜疾病相关，包括视网膜色素变性和锥形细胞变性。此外，Guca1b的表达与肠道功能密切相关，它是一种内源性配体，与肠道受体鸟苷酸环化酶-C (GC-C) 结合，刺激环状GMP的增加，并通过囊性纤维化跨膜传导调节器诱导氯分泌。这些发现表明，Guca1b在视网膜疾病和肠道功能中发挥着重要作用，对深入了解视网膜疾病和肠道功能的发展机制具有重要意义。