Usp16-flox 基因敲除小鼠

Usp16，全称为Ubiquitin Specific Peptidase 16，是一种重要的去泛素化酶，它在多种生物学过程中发挥关键作用，包括基因表达调控、细胞周期进程、DNA损伤修复等。Usp16最初被发现是组蛋白H2A的主要去泛素化酶，后来又发现它可以去除多种其他底物的泛素化，这些底物既包括细胞质中的蛋白质也包括细胞核中的蛋白质。Usp16在细胞进入有丝分裂时会被磷酸化，而在中期/后期转换过程中则会被去磷酸化。尽管Usp16的大部分位于细胞质中，但将其从底物中分离出来被认为是一种重要的调节机制。Usp16与DNA损伤修复、免疫疾病、肿瘤发生、蛋白质合成、冠状动脉健康和男性不育等多种功能相关。由于其与免疫反应的密切联系以及USP16是多种致癌基因产物的底物，因此USP16被认为是某些人类疾病治疗的潜在靶点[5]。

NFκB信号通路可以激活USP16基因的表达。研究发现，人类USP16基因的5'侧翼区域（-1856bp ~ +468bp）含有控制其转录的功能启动子。在这个启动子中发现了三个NFκB结合位点。进一步研究发现，p65的过表达增强了内源性USP16 mRNA水平。此外，LPS和TNFα，作为NFκB通路的强效激活剂，上调了USP16的转录。这些结果表明，USP16基因表达在转录水平上受到严格调控。NFκB信号通路通过三个顺式作用元件调节人类USP16基因的表达。这一研究结果为USP16表达失调在唐氏综合症中的潜在作用提供了新的见解[1]。

USP16基因的拷贝数变异（CNV）与牛奶性状相关。研究发现，USP16基因CNV对每日产奶量和脂肪百分比对有显著差异（p < 0.05）。在每日产奶量中，增益是有利的类型，而在脂肪百分比对中，损失是有利的类型。因此，USP16基因CNV是影响中国荷斯坦牛牛奶性状的重要因素。同时，它可以用作辅助选择牛奶性状的分子标记，为中国奶牛品种的遗传改良提供理论基础[2]。

使用CRISPR-Cas9系统对人类单核细胞白血病细胞系THP-1中的USP16基因进行编辑，产生了四个纯合子敲除克隆。所有这些克隆都能在佛波酯（PMA）处理后增殖和分化。其中一个细胞系在PMA处理前具有高度增殖性，并且在分化时停止增殖，类似于野生型。三个克隆显示了祖细胞标记MYB的持续表达，表明在这些克隆中分化并没有完全阻止增殖。转录组差异的网络分析表明，所有细胞系中在分化后都有基因的升高或降低。在PMA处理之前，纯合子克隆中与代谢和线粒体相关的基因水平低于野生型，包括编码USP16相互作用伙伴的SRPRB。还观察到干扰素信号通路丢失。相反，与野生型相比，纯合子细胞在基线水平上有许多基因的表达上调，包括其他去泛素化酶（USP12、BAP1和MYSM1）。然而，三个纯合子未能完全诱导分化过程中的USP3。其他网络簇显示在纯合子克隆中，在分化之前或之后都有影响。因此，USP16的缺失影响了细胞的转录组，尽管所有这些细胞系都能存活，这表明归因于USP16的功能可能是冗余的。这一分析表明，白血病细胞系可以通过不同的补偿途径适应USP16缺失带来的极端选择压力，以及基因编辑和选择方案中的严酷条件。类似的选择压力在体内癌症的进化过程中发生，因此，这些结果可以被看作是白血病细胞适应的一个案例研究。USP16已被认为是癌症化疗的靶点，但结果表明，治疗会选择对USP16抑制剂有抗性的逃逸突变体[3]。

O-GlcNAcylation可以刺激USP16的去泛素化活性并调节细胞周期进程。研究发现，组蛋白2A单泛素化（uH2A）是基因表达的关键表观遗传调控。该研究首先证实USP16在Thr203和Ser214位点上被糖基化，然后发现突变O-GlcNAcylation位点Thr203会降低USP16对H2AK119ub的去泛素化活性，而突变Ser214位点则有相反的效果。使用USP16 Ser552磷酸化特异性抗体，研究证实O-GlcNAcylation拮抗了细胞周期蛋白依赖性激酶1介导的磷酸化，并促进USP16的核输出。USP16的O-GlcNAcylation还对于去泛素化Polo样激酶1（一种有丝分裂主激酶）以及随后的染色体分离和细胞分裂是必需的。总的来说，该研究揭示了USP16在Thr203和Ser214位点的O-GlcNAcylation协调了uH2A和Polo样激酶1的去泛素化，从而确保了适当的细胞周期进程[4]。

在人类和老鼠中，CEP78的功能丧失突变会导致男性不育。研究发现，在男性不育患者中，CEP78的致病性剪接突变导致精子数量和活力严重减少，以及精子鞭毛表型的典型多形态异常。进一步创建的Cep78敲除小鼠表现出极低的精子数量，完全异常的精子形态，以及大约零的精子活力。患者和敲除小鼠的生育能力无法通过胞浆内单精子注射治疗来挽救。机制上，CEP78可能通过泛素化途径调节USP16的表达，从而进一步稳定Tektin的水平。Cep78敲除小鼠还表现出视网膜和外毛细胞功能的损害。总的来说，这些发现确定了非功能性CEP78是导致男性不育的不可或缺因素，并揭示了该基因在调节小鼠视网膜和外毛细胞功能中的作用[6]。

Usp16的去泛素化活性对胚胎干细胞（ESC）的基因表达和谱系决定至关重要。研究发现，Usp16，一种组蛋白H2A去泛素化酶，调节ESC中的H2A去泛素化和基因表达，并且在ESC分化过程中是必需的。Usp16敲除在老鼠中是胚胎致死的，但不会影响ESC的活力或身份。Usp16结合到ESC中大量基因的启动子区域，Usp16的结合与ubH2A水平呈负相关，与基因表达水平呈正相关。有趣的是，Usp16(-/-) ESCs由于ubH2A介导的谱系特异性基因的抑制而无法分化。最终，Usp16，而不是一个催化失活的突变体，挽救了Usp16(-/-) ESCs的分化缺陷。因此，这项研究确定了Usp16和H2A去泛素化是ESC基因表达和分化的关键调节因子[7]。

USP16-H2AK119ub核小体复合物的冷冻电子断层扫描（cryo-EM）结构揭示了USP16与H2AK119ub核小体的识别和去泛素化机制。该结构与多亚基PR-DUB复合物的催化机制不同，包括独立于H2A-H2B酸性斑点的核小体识别模式，以及Ub基序和组蛋白H2A C端尾部的构象异质性。这项工作突出了H2AK119ub去泛素化的机制多样性，并为理解USP16的疾病相关突变提供了结构框架[8]。

lncEPAT在胶质母细胞瘤（GBM）发生过程中通过连接失调的EGFR通路和组蛋白H2A去泛素化发挥关键作用。研究发现，lncEPAT被EGFR通路诱导，高水平表达与胶质瘤分级呈正相关，并预测胶质瘤患者预后较差。质谱分析表明，lncEPAT与去泛素化酶USP16特异性相互作用。lncEPAT抑制USP16招募到染色质，从而阻止USP16介导的H2A去泛素化，并抑制目标基因的表达，包括CDKN1A和CLUSTERIN。lncEPAT的耗尽促进了USP16诱导的细胞周期阻滞和细胞衰老，进而抑制GBM细胞肿瘤发生。因此，EGFR-lncEPAT-ubH2A偶联代表了一种以前未知的表观遗传基因调控和衰老抵抗机制，在GBM肿瘤发生过程中发挥作用[9]。

在阿尔茨海默病（AD）模型中，抑制USP16可以挽救干细胞衰老和记忆力。研究发现，在AD小鼠模型和携带突变型淀粉样前体蛋白的人类胎儿细胞中，细胞内在的神经祖细胞（NPC）功能障碍先于广泛的炎症和淀粉样斑块病理出现，使其成为疾病发展过程中的最早缺陷。研究证明，通过遗传减少USP16，即组蛋白修饰剂和多梳抑制复合物1（PRC1）的关键生理拮抗剂，可以逆转受损的NPC自我更新，从而防止下游的认知缺陷并减少体内的星形胶质细胞增生。USP16的减少导致衰老基因Cdkn2a的表达下调，并减轻了USP16的先前未知功能——骨形态发生蛋白（BMP）信号通路的异常调节。因此，研究揭示了USP16是AD模型中的新靶点，它可以通过调节Cdkn2a和BMP信号通路来改善NPC缺陷并挽救记忆和学习[10]。

综上所述，Usp16作为一种重要的去泛素化酶，在多种生物学过程中发挥着关键作用。它通过调节基因表达、细胞周期进程、DNA损伤修复等功能，影响细胞的生长、分化和死亡。Usp16的表达和活性受到多种因素的调控，包括NFκB信号通路、拷贝数变异、O-GlcNAcylation、CEP78等。USP16的异常表达和活性与多种疾病的发生和发展相关，包括唐氏综合症、牛奶性状、男性不育、胚胎干细胞分化、胶质母细胞瘤和阿尔茨海默病等。因此，USP16被认为是治疗某些人类疾病的潜在靶点，其研究有助于深入理解表观遗传调控的生物学功能和疾病发生机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。