Atf2-flox 基因敲除小鼠

ATF2，即激活转录因子2，是一种重要的转录因子，编码的蛋白质在正常细胞发育和生存中发挥着关键作用。除了其作为转录因子的功能外，ATF2还在DNA损伤应答和组蛋白乙酰转移酶（HAT）复合物活性的控制中发挥作用。目前，人类肿瘤中尚未发现ATF2的基因变化。然而，ATF2的表达和亚细胞定位的改变与肿瘤分期和预后相关。在黑色素瘤肿瘤模型中的研究表明，ATF2的致癌活性与该肿瘤类型的发展相关。抑制ATF2足以阻碍黑色素瘤的发展。然而，在其他肿瘤模型中，包括乳腺癌和皮肤肿瘤，ATF2与突变的致癌基因或肿瘤抑制基因协同作用，也能发挥肿瘤抑制功能。这些发现表明ATF2具有组织-肿瘤特异性功能[1]。

ATF2还通过cAMP反应元件（G-CRE）在Gγ-珠蛋白基因的调控中发挥作用。G-CRE在Gγ-珠蛋白表达调控中起着重要作用，通过结合ATF2及其DNA结合伴侣来实现。ATF2的敲低导致γ-珠蛋白表达显著减少，伴随ATF2与G-CRE结合的减少。相反，在K562细胞中稳定表达ATF2增加了γ-珠蛋白的转录，而ATF2的敲低则减少了这种转录。此外，在初级红细胞祖细胞中也观察到了ATF2对γ-珠蛋白表达的相似影响。为了理解ATF2在γ-珠蛋白表达中的作用，通过质谱分析对层析纯化的G-CRE/ATF2相互作用蛋白进行了研究；主要的结合伴侣包括CREB1、cJun、Brg1和组蛋白脱乙酰酶等。免疫沉淀实验证明了这些蛋白与ATF2的相互作用以及在红细胞分化过程中的CD34(+)细胞中的GCRE结合，这与γ-珠蛋白表达在发育过程中的变化相关。这些结果表明，ATF2蛋白复合物的发育阶段特异性招募与红细胞生成过程中γ-珠蛋白的表达之间存在协同作用。在K562细胞中的微阵列研究表明，ATF2在造血和染色质重塑中发挥着多种作用[2]。

JNK和p38蛋白激酶可以通过磷酸化依赖性转录因子ATF2的底物，以依赖性方式促进或抑制肿瘤生长。阐明JNK和p38的特定底物的功能对于理解这些激酶在癌症中的作用至关重要。研究表明，ATF2通过JNK激活的基因表达程序抑制肿瘤形成。在正位肝肿瘤模型和体外细胞转化中，ATF2抑制了肿瘤形成。此外，还发现JNK抑制肿瘤形成需要ATF2。通过ATF2激活的JNK转录程序，提供了JNK和ATF2依赖性基因的例子，这些基因可以阻止细胞转化。值得注意的是，ATF2依赖性基因表达在人类癌症中经常下调，表明JNK-ATF2介导的抑制减弱可能是肿瘤发展过程中的常见事件[3]。

ATF2基因还参与油酸菌Rhodococcus opacus PD630中的甘油三酯（TAG）生物合成和积累。R. opacus PD630是一种能够在不同碳源中积累大量TAG的油酸菌。TAG生物合成的最后一步是由atf基因编码的双功能蜡酯合酶/酰基辅酶A：二酰基甘油酰转移酶（WS/DGAT）酶催化的。R. opacus PD630在其基因组中至少拥有17个atf同源基因，但只有atf1和atf2在E. coli中表现出显著的DGAT活性。先前的研究已经证明了atf1基因对TAG积累的贡献，尽管其他Atfs也可能对脂质积累有贡献，因为atf1基因敲除突变体仍然能够产生大量的TAG。本研究通过使用不同的遗传策略，调查了atf2基因在R. opacus PD630中TAG积累的体内作用。atf2基因敲除突变体显示出TAG积累的减少（高达25-30%，w/w）和与野生型菌株相比，糖原形成大约增加了十倍。令人惊讶的是，与单突变体相比，通过敲除atf1和atf2基因产生的双突变体在脂质储存条件下，对TAG和糖原积累的影响非常小。在PD630菌株中过表达atf1和atf2基因促进了TAG积累的增加（大约10%，w/w），而在富含氮的培养基中，异源表达atf2基因导致Mycobacterium smegmatis中TAG积累的增加。这项研究证明了，除了atf1基因外，atf2基因也积极参与了油酸菌R. opacus PD630中的TAG积累[4]。

ATF2还被确定为肾素基因的转录调节因子。在肾素基因远端增强子调控区域的cAMP反应元件（enhCRE）被认为在肾素转录控制中起着重要作用。enhCRE结合CRE结合蛋白（CREB），这是cAMP信号传导的主要转录因子靶点。使用小鼠肾素产生细胞系As4.1，发现激活转录因子-2（ATF2）也结合到enhCRE。ATF2的N端磷酸化，控制其转录激活，与肿瘤坏死因子-α（TNFα）下调肾素基因表达相关。泛素蛋白酶体抑制剂MG132也磷酸化ATF2并抑制肾素表达。ATF2的敲低减弱了MG132对肾素基因表达的抑制作用，从而证明了ATF2介导了MG132的抑制作用。此外，MG132增加了ATF2的DNA结合以及ATF2与CREB的结合比例。使用ATF2和CREB-Gal4融合蛋白构建体和荧光素酶报告系统，表明ATF2的转录激活能力比CREB弱。这些数据表明，ATF2通过将肾素基因的转录控制从CREB转移开来，从而抑制肾素表达。因此，TNFα完全消除了cAMP依赖性肾素基因表达的刺激[5]。

c-Jun和ATF2通过URE2和URE4协同激活C/EBPbeta基因的表达。C/EBPbeta是负责诱导大量基因的关键转录因子之一。与许多原癌基因和转录因子一样，C/EBPbeta基因的转录可以被多种细胞外信号诱导。使用脂多糖（LPS）刺激的小鼠肝脏核提取物，通过DNAse I足迹分析确定了五个反式作用因子结合基序，URE1（-376至-352）、URE2（-253至-223）、URE3（-220至-190）、URE4（-123至-103）和URE5（-72至-45）。对URE2和URE4形成的复合物的竞争和超移位分析表明，它们包含CREB/ATF和AP-1家族因子。此外，从哺乳动物和细菌细胞中获得的重组ATF2和c-Jun蛋白可以结合到URE2和URE4，但不能结合到URE1。共转化实验表明，ATF2和c-Jun通过URE2和URE4协同激活C/EBPbeta基因表达，并且在低浓度安丝霉素处理下，这种激活大大增加。在急性期反应中，发现c-Jun和ATF2的磷酸化与C/EBPbeta基因表达相关。总的来说，我们的结果提供了证据，表明c-Jun和ATF2是C/EBPbeta基因的调节因子[6]。

在伪狂犬病毒（PRV）复制中，ATF2起着关键作用。PRV是家畜伪狂犬病的病原体，已对全球养猪业造成了负面影响。上皮细胞被认为是PRV感染的第一位点。然而，宿主蛋白及其相关信号通路在PRV复制中的作用尚不清楚。在这项研究中，我们对PRV感染的猪肾（PK-15）上皮细胞进行了定量磷酸化蛋白质组学筛选。共获得了5723个磷酸肽，对应于2180个蛋白，与未感染细胞相比，810个蛋白的磷酸化状态在PRV感染细胞中发生了显著变化（P<0.05）。GO和KEGG分析表明，这些差异表达的磷酸化蛋白主要与RNA转运和MAPK信号通路相关。进一步对MAPK信号通路中的NF-κB、转录激活因子-2（ATF2）、MAX和SOS基因的功能研究使用RNA干扰（RNAi）敲低。结果表明，只有ATF2敲低降低了PRV效价和病毒基因组拷贝数。JNK通路抑制和CRISPR/Cas9基因敲除表明，ATF2对PRV的有效复制是必需的，尤其是在病毒基因组DNA的生物合成过程中。随后，通过过表达ATF2基因和ATF2氨基酸位置69/71的点突变，进一步证明了ATF2的磷酸化促进了PRV复制。这些发现表明，ATF2可能是抑制PRV感染的治疗靶点[7]。

ATF2和AP1网络在癌症中的新兴作用。转录因子之间的协同作用对于它们执行特定的转录程序至关重要。AP1复合物是一个转录因子网络，在正常情况下和肿瘤发生和进展过程中协同工作。这篇综述总结了我们对AP1复合物成员的变化以及ATF2作为该复合物一部分在肿瘤发生中的作用的理解[8]。

在由活动剥夺诱导的小脑颗粒神经元（CGNs）凋亡中，Caspase-3是c-Jun:ATF2异源二聚体的靶基因。Caspase-3是神经元凋亡的关键执行者，在由活动剥夺诱导的CGNs凋亡中被上调和激活。然而，CGNs凋亡过程中调节caspase-3的转录机制尚不清楚。研究表明，在CGNs活动剥夺后，c-Jun NH2-末端激酶（JNK）/c-Jun:ATF2通路的激活先于caspase-3基因的转录激活。观察到caspase-3的诱导被JNK/c-Jun:ATF2通路的药理学抑制所消除。使用显性负性突变体破坏c-Jun:ATF2异源二聚体或通过小RNA干扰敲低，减少了caspase-3启动子活性和mRNA水平。此外，染色质免疫沉淀显示，在活动剥夺的体内，c-Jun:ATF2异源二聚体与caspase-3启动子的结合增加。定向突变caspase-3启动子表明，caspase-3的转录激活主要依赖于启动子上游-233至-225核苷酸处的ATF位点。总的来说，这些数据表明，Caspase-3是c-Jun:ATF2异源二聚体在由活动剥夺诱导的CGNs凋亡中的靶基因[9]。

内含子microRNA hsa-miR-933对其宿主基因ATF2的调节功能的改变导致了2型糖尿病和神经退行性疾病的发展。microRNAs是约22核苷酸长的生物调节因子，作为基因表达的转录后调节因子。其中一些被发现嵌入在蛋白质编码基因的内含子中，这些miRNAs被称为内含子miRNAs。先前的研究表明，这些内含子miRNAs与其宿主基因共表达。这种共表达对于维持生物系统的稳健性是必要的。迄今为止，只有少数实验离散地进行了实验，以阐明几个共表达的内含子miRNAs与其相关宿主基因之间的功能关系。在这项研究中，我们解释了内含子miRNA hsa-miR-933对其靶宿主基因ATF2的调节机制，并发现异常可能导致多种疾病。采用蛋白质-蛋白质相互作用网络方法，并进行了功能富集分析，以阐明共同靶点的显著过度代表的生物学功能和途径。我们的方法阐明了hsa-miR-933可能通过调节ATF2的靶基因MAP4K4、PRKCE、PEA15、BDNF、PRKACB和GNAS来控制高血糖症和高胰岛素血症，否则会导致2型糖尿病的发展。此外，我们表明hsa-miR-933可以通过调节ATF2的靶点脑源性神经营养因子（BDNF）来调节神经元细胞中ATF2的最佳表达，从而为神经退行性疾病的抑制提供神经保护。我们的计算机模型为在模式生物或细胞系中进行进一步的实验验证提供了有趣的资源。这些发现可能扩展了基因表达分析中的常见观念，引入了新的调节功能[10]。

综上所述，ATF2是一种重要的转录因子，在正常细胞发育和生存、DNA损伤应答、甘油三酯生物合成和积累、肾素基因的转录调控、C/EBPbeta基因的转录激活、伪狂犬病毒复制以及癌症发展中发挥着关键作用。ATF2与多种蛋白质和信号通路相互作用，参与调控多种生物学过程。ATF2的研究有助于深入理解其功能和疾病发生机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。