Polq-KO 基因敲除小鼠

基因Polq，也称为DNA聚合酶θ（Polθ），是编码DNA聚合酶θ的基因，属于DNA修复酶家族。Polθ在许多真核生物的基因组中存在，但不在真菌基因组中。Polθ蛋白的C端包含一个家族A DNA聚合酶结构域，而N端则包含一个类似解旋酶的结构域，具有DNA依赖性ATP酶活性。Polθ在DNA双链断裂（DSB）的修复中起着重要作用，包括由电离辐射、拓扑异构酶抑制剂引起的DSB，以及在DNA复制叉停滞、哺乳动物免疫系统多样化步骤以及CRISPR-Cas9介导的DSB修复中发挥作用。Polθ参与一种称为“替代末端连接”（altEJ）的DSB修复途径，该途径不依赖于DNA结合的Ku蛋白复合物，并需要DNA末端切除。Polθ能够介导具有DNA序列微同源性的两个切除的3'末端连接。Polθ在altEJ中的作用特征是频繁使用较长的微同源性和在连接位点插入额外的序列。末端连接的机制利用了Polθ通过活性位点的独特接触紧紧抓住3'末端的能力，从而允许从最小配对的引物处延伸。Polθ参与控制染色体易位的频率，并通过限制大片段的删除来维持基因组完整性。它还可能在DNA碱基切除修复中发挥备份作用。POLQ基因的表达与乳腺癌、卵巢癌和其他癌症类型的较差临床预后密切相关。因此，抑制Polθ被认为是肿瘤放疗增敏的一种有吸引力的方法[10]。

在BRCA1/2缺陷的癌细胞中，Polθ是双链断裂修复的关键效应因子，通过微同源末端连接（MMEJ）途径发挥作用。Polθ缺乏的细胞在BRCA1/2缺失或PARP抑制剂处理后，会积累复制后的单链DNA间隙。Polθ的解旋酶和聚合酶活性之间的协同作用促进RPA位移和单链DNA间隙的填充。此外，Polθ还能够进行微同源介导的间隙跳跃（MMGS），在间隙修复过程中产生类似于Polq过表达癌症中普遍存在的基因组瘢痕的缺失。这些发现表明，Polq在致癌的复制后间隙封堵中发挥作用，这可能推动癌症中的基因组进化，而Polq的缺失使细胞对同源重组（HR）途径的保护和修复以及细胞活力产生了关键依赖[1]。

在衣藻中，Polq对于CRISPR/Cas9介导的基因靶向是必需的。使用CRISPR/SpCas9技术，研究者生成了DNA修复缺陷型突变体ku80、ku70、polQ，用于基因靶向实验。结果表明，SpCas9诱导的双链断裂的非模板修复导致突变谱与KU80/KU70和POLQ的参与一致。此外，POLQ的失活被发现对使用供体单链寡核苷酸进行的失活paromomycin-resistant mut-aphVIII基因的同源定向修复（HDR）/基因失活产生负面影响。然而，mut-aphVIII在这些突变体中仍然通过同源重组得到修复。POLQ失活抑制了与供体ssDNA共转化时转基因的随机整合。KU80缺乏对这些事件没有影响，相反，KU80/KU70被发现可以刺激HDR/基因失活。这些数据表明，在衣藻中，POLQ是CRISPR/Cas9介导的HDR和转基因随机整合的主要贡献者，而KU80/KU70可能发挥次要作用[2]。

在HR缺陷的胰腺腺癌中，Polq抑制通过cGAS/STING信号传导途径引发免疫反应。胰腺导管腺癌（PDAC）是一种高度致命的恶性肿瘤，在20%-25%的病例中存在HR修复蛋白的突变。HR缺陷赋予肿瘤细胞对聚ADP核糖聚合酶抑制剂和含铂化疗的特定易损性。然而，并非所有接受这些治疗的患者都能响应，许多最初响应的患者最终会产生耐药性。HR途径的失活与Polθ（Polθ，或POLQ）的过表达相关，Polθ是一种关键酶，调节DSB修复的微同源末端连接（MMEJ）途径。使用人类和小鼠HR缺陷的PDAC模型，研究者发现，Polq敲低与HR基因（如BRCA1和BRCA2）和DNA损伤修复基因ATM的突变相结合时，是合成致死的。此外，Polq敲低增强了细胞质微核的形成并激活了环状GMP-AMP合成酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）的信号传导，导致在体内BRCA2缺陷的PDAC肿瘤中浸润的活化的CD8+ T细胞增加。总的来说，Polq是BRCA2缺陷PDAC中MMEJ途径的关键介导因子，对DSB修复至关重要。其抑制代表了通过同时激活cGAS-STING信号传导途径来增强肿瘤免疫浸润的合成致死方法，突出了Polq在肿瘤免疫环境中的新作用[3]。

在BRCA1突变型乳腺癌细胞中，通过甲硫氨酸限制诱导DNA修复基因POLQ的表达。BRCA1/2突变在乳腺癌细胞中损害同源重组并促进替代末端连接（Alt-EJ）进行DNA损伤修复。DNA聚合酶θ由POLQ编码，在Alt-EJ中起重要作用，使其成为BRCA1/2突变癌症的潜在治疗靶点。甲硫氨酸限制是一种有前景的靶向癌细胞的方法，因为癌细胞对该氨基酸有依赖性。本研究调查了在正常、血清限制或血清和甲硫氨酸限制条件下，BRCA1/2野生型和BRCA1突变型乳腺癌细胞中POLQ的mRNA表达。与BRCA1/2野生型细胞相比，BRCA1突变型细胞在正常培养基中显示出显著更高的POLQ基础表达。甲硫氨酸限制进一步增加了BRCA1突变型细胞中的POLQ表达，但在BRCA1/2野生型细胞中降低了POLQ表达。这些发现表明，甲硫氨酸限制对POLQ表达显示出不同的影响，这可能影响BRCA1/2野生型和BRCA1突变型乳腺癌细胞中的Alt-EJ活性。需要进一步研究以探索将甲硫氨酸限制与DNA修复抑制剂（如PARP抑制剂）相结合的潜力，以克服BRCA1/2突变癌症中的药物耐药性[4]。

在HR缺陷的肿瘤中，肿瘤细胞依赖于Polθ介导的修复。大规模全基因组研究显示，一半的上皮性卵巢癌（EOCs）在调节同源重组（HR）修复的基因中存在改变。HR的丧失导致了EOCs的基因组不稳定，以及它们对替代多聚ADP核糖聚合酶（PARP）介导的DNA修复机制的细胞超依赖。先前的研究已经暗示DNA聚合酶θ（Polθ，也称为POLQ，由POLQ编码）参与了一条需要用于DSB修复的途径，称为错误倾向的微同源末端连接（MMEJ）途径。Polθ是否与经典的DNA修复途径相互作用以防止基因组不稳定尚不清楚。研究者报告了EOCs中HR活性和Polθ表达之间的负相关。在HR活性细胞中敲低Polθ上调了HR活性和RAD51核丝的组装，而在HR缺陷的EOCs中敲低Polθ增强了细胞死亡。与这些结果一致，在小鼠中遗传失活HR基因（Fancd2）和Polq导致胚胎致死。此外，Polθ包含RAD51结合基序，并且它阻止RAD51介导的重组。这些结果揭示了一个HR途径与Polθ介导的修复之间的合成致死关系，并将Polθ鉴定为EOCs中一个新的可药物靶点[5]。

在癌症中，对DNA修复抑制剂的耐药性是一个常见现象，它损害了癌症治疗的总体有效性。目前，一系列针对DDR（DNA损伤反应）的新靶点，包括ATR激酶、WRN解旋酶或DNA聚合酶/解旋酶Polθ（Pol-Theta）的抑制剂，正在临床前或临床研究中。PARP抑制剂（PARPi）的使用是治疗具有HR DDR途径缺陷的癌症的一个例子。耐药性是癌症治疗中的一个常见问题，目前已有一些关于PARPi耐药性发生机制的了解。研究者讨论了如何通过了解PARPi耐药性来了解新的针对DDR的药物耐药性如何出现。研究者还讨论了可能限制这些治疗耐药机制在癌症中影响的潜在策略[6]。

使用整合的生物信息学分析和实验验证，研究者确定了POLQ是宫颈癌进展中的关键基因。作为最常见的妇科恶性肿瘤，宫颈癌（CC）对健康构成严重威胁。因此，本研究旨在使用整合的生物信息学分析和实验验证来确定CC进展中的关键基因。从基因表达综合数据库中获得了mRNA微阵列GSE63514和miRNA微阵列GSE86100，并确定了CC进展中的差异表达基因（DEGs）和差异表达miRNA（DEMs）。之后，进行了GO和KEGG功能富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和显著子网络构建，以及miRNA-靶向调控网络构建。基于整合的生物信息学分析结果，在PPI网络中确定了SMC4、ATAD2和DNA聚合酶θ（POLQ）为枢纽基因，并参与了第一个显著子网络。此外，这些DEGs被预测受到miR-106B、miR-17-5P、miR-20A和miR-20B的调控，这些miRNA被鉴定为DEMs。值得注意的是，SMC4和ATAD2在CC中是肿瘤促进剂。在本研究中，使用小干扰（si）RNA下调POLQ的表达。细胞计数试剂盒-8、Transwell、细胞周期和凋亡分析表明，POLQ的下调抑制了细胞增殖、迁移和侵袭，并促进了细胞凋亡和细胞周期的G2期阻滞。总的来说，POLQ，可能与SMC4和ATAD2密切相关，可能在CC的进展中发挥重要作用[7]。

RHINO指导MMEJ修复有丝分裂中的DNA断裂。非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）是间期修复DNA双链断裂（DSBs）的主要途径，而微同源末端连接（MMEJ）被认为是一种备用机制。通过在癌细胞中基于CRISPR-Cas9的合成致死筛选，研究者确定了9-1-1复合物（RAD9A-RAD1-HUS1）的亚基及其相互作用伙伴RHINO是关键的MMEJ因子。研究者揭示了RHINO在将MMEJ限制在有丝分裂中的意外功能。RHINO在有丝分裂期积累，经历Polo样激酶1（PLK1）的磷酸化，并与聚合酶θ（Polθ）相互作用，使其募集到DSBs进行后续修复。此外，研究者提供了证据，表明有丝分裂中的MMEJ活性修复了起源于S期的持续DSBs。这些发现为POLQ和BRCA1和BRAC2基因之间的合成致死关系以及Polθ和聚ADP核糖聚合酶（PARP）抑制剂之间的协同作用提供了见解[8]。

小分子Polθ抑制剂为临床前模型中的肿瘤放疗增敏提供了安全和有效的肿瘤放疗增敏。DNA聚合酶θ（Polθ，由POLQ基因编码）是一种对微同源介导的末端连接（MMEJ）至关重要的DNA修复酶。Polθ在正常组织中的表达有限，但在癌细胞中经常过表达，因此是肿瘤特异性放疗增敏的理想靶点。本研究评估了使用新型小分子抑制剂靶向Polθ以提高放疗疗效的可行性。研究者评估了Polθ抑制与不同癌症细胞模型中离子辐射结合的体外和体内反应。研究者发现，ART558和ART899两种新型和特异的Polθ DNA聚合酶结构域变构抑制剂，在分次辐射结合时，有效地使肿瘤细胞放疗增敏。重要的是，非癌细胞未被Polθ抑制放疗增敏。从机制上讲，研究者发现，由Polθ抑制引起的放疗增敏在复制细胞中最有效，并且是由于DNA损伤修复受损。研究者还表明，放疗增敏在缺氧条件下仍然有效，这表明这些抑制剂可能有助于克服缺氧诱导的放疗抗性。此外，研究者首次描述了ART899，并将其表征为一种具有改善代谢稳定性的有效和特异的Polθ抑制剂。在体内，使用ART899进行Polθ抑制与分次辐射的结合具有良好的耐受性，并导致与单独放疗相比，肿瘤生长显著减少。这些结果为未来Polθ抑制剂与放疗结合的临床试验铺平了道路[9]。

综上所述，Polq在DNA修复、基因组稳定性和癌症发生发展中发挥着重要作用。Polq参与MMEJ途径，通过介导具有微同源性的DNA末端连接来修复DSBs。Polq的抑制可以导致DNA损伤修复受损，从而增加癌细胞对放疗的敏感性。此外，Polq的表达与多种癌症类型的较差临床预后相关，使其成为癌症治疗的潜在靶点。Polq的研究有助于深入理解DNA修复机制和癌症发生发展的分子基础，为癌症的治疗和预防提供新的思路和策略。