Gadd45g-KO 基因敲除小鼠

GADD45g，全称Growth Arrest and DNA Damage-inducible, gamma，是一种在细胞周期调控、DNA损伤修复和细胞凋亡中发挥重要作用的基因。GADD45g属于GADD45基因家族，该家族成员在应对环境压力、细胞分化、生长停滞和细胞凋亡等方面具有独特的表达模式。GADD45g蛋白与多种细胞周期和细胞存活调节蛋白相互作用，如增殖细胞核抗原（PCNA）、p21（WAF1/CIP1）、细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1，cdc2-p34）和MTK1/MEKK4，并影响p38和JNK激酶的活性。GADD45g基因在进化上高度保守，其基因结构与其他家族成员相似，包括四个外显子和三个内含子。GADD45g基因在所有正常成年和胎儿组织中广泛表达，但在多种肿瘤细胞系中，其启动子高甲基化导致其转录沉默或下调，表明GADD45g可能是一种功能性的肿瘤抑制因子。此外，GADD45g基因在性决定中也发挥重要作用，早期、 robust的Sry表达依赖于GADD45g，Gadd45g基因敲除的XY胚胎在11.5 dpc时Sry水平显著降低，导致XY性腺性别反转。GADD45g基因的激活通常与对环境压力的反应有关，如热休克或紫外线照射，但在某些肿瘤中，这种应激反应由于启动子的高甲基化而受损。总之，GADD45g基因在多种生物学过程中发挥重要作用，包括细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞凋亡和性决定。GADD45g基因的异常表达和功能丧失可能与多种疾病的发生和发展有关，包括非酒精性脂肪肝疾病、阿尔茨海默病、急性髓细胞性白血病、肾小管细胞凋亡和肝细胞癌等。因此，GADD45g基因可能成为治疗这些疾病的重要靶点。

非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）和阿尔茨海默病（AD）是全球性的健康挑战。最近的研究表明，这两种疾病之间存在联系，但其潜在的机制尚不清楚。一项研究利用生物信息学方法分析了来自基因表达综合数据库（GEO）的NAFLD和AD数据集，旨在解码这两种疾病的共享分子特征。研究通过差异表达基因（DEGs）分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和机器学习进行生物标志物发现。研究确定了14个在NAFLD和AD中共同表达的基因，并通过机器学习确定了NAFLD和AD的诊断生物标志物。进一步的研究表明，GADD45G和NUPR1是与NAFLD和AD相关的关键生物标志物，在疾病相关的分子通路中发挥着复杂的作用。免疫细胞分析强调了巨噬细胞在这些疾病条件下的重要性。这项研究为NAFLD和AD的治疗提供了新的见解，并揭示了潜在的靶向治疗靶点，特别是在巨噬细胞介导的通路中[1]。

生长停滞和DNA损伤诱导γ（GADD45G）是一种与繁殖相关的基因。一项研究通过快速扩增cDNA末端（RACE）方法克隆了猪GADD45G基因的全长cDNA序列。猪GADD45G基因编码一个159个氨基酸的蛋白质，与九种物种的GADD45G具有较高的同源性：黑猩猩（97%）、苏门答腊猩猩（97%）、白耳猴（97%）、北方白颊黑长臂猿（97%）、牛（97%）、人类（97%）、猕猴（97%）、大鼠（96%）和小鼠（95%）。这项研究还发现猪GADD45G基因在编码序列的294-bp位置存在一个A/G突变，并且在该突变位点，八个猪品种表现出明显的基因型和等位基因频率差异。关联分析表明，这个多态性位点与大型白猪和兰德瑞斯猪的产仔数显著相关。因此，猪GADD45G基因可能是一个有用的候选基因，可用于增加产仔数的选择。这些数据为进一步了解这个新型猪基因奠定了基础[2]。

黑色素瘤相关抗原H1（MAGEH1）是一种属于黑色素瘤相关抗原（MAGE）超家族的蛋白质。生长停滞和DNA损伤45G（GADD45G）是DNA损伤诱导基因家族的成员，对环境压力作出反应。一项研究表明，GADD45G是一种促进肾小管细胞在肾毒性损伤中发生凋亡的蛋白质。研究使用人肾小管上皮细胞（HRE）和人肾2（HK-2）细胞进行实验，并通过慢病毒载体和短发夹RNA（shRNA）构建稳定细胞系以沉默MAGEH1和GADD45G的表达。研究使用RNA干扰（siRNA）在HK-2细胞中实现基因的瞬时沉默，并通过重组腺病毒过表达MAGEH1和GADD45G蛋白。研究使用人蛋白质芯片检测与GADD45G结合的蛋白质，并通过免疫共沉淀实验验证芯片结果。研究使用环孢素A（CsA）诱导细胞死亡，并通过流式细胞术评估培养细胞的凋亡和坏死程度。研究还通过蛋白质印迹分析检测caspases的表达水平。研究结果表明，GADD45G与蛋白质芯片中一个蛋白质斑点结合，该蛋白质随后被鉴定为MAGEH1。研究通过免疫共沉淀实验确认了GADD45G和MAGEH1蛋白之间的相互作用。研究还发现，MAGEH1基因表达在CsA诱导的细胞毒性损伤中未发生变化，而GADD45G基因表达在CsA处理后显著增加。MAGEH1基因表达在GADD45G敲低HRE稳定细胞中显著下调，表明MAGEH1表达可能依赖于GADD45G表达。CsA诱导的凋亡在MAGEH1敲低HRE稳定细胞中显著降低，导致这些细胞的存活增加。在GADD45G敲低HRE稳定细胞中也观察到了类似的结果。此外，CsA诱导的凋亡在MAGEH1 siRNA和GADD45G siRNA转染的HK-2细胞中显著降低。CsA诱导的caspase-7和caspase-9激活在MAGEH1敲低HRE稳定细胞中受到抑制，在GADD45G敲低HRE稳定细胞中也观察到类似的结果。这项研究首次表明MAGEH1与GADD45G相互作用，并且MAGEH1参与由肾毒性药物诱导的肾小管细胞的caspase依赖性凋亡[3]。

急性髓细胞性白血病（AML）是一种侵袭性的血液系统恶性肿瘤，目前缺乏有效的治疗方法。一项研究将生长停滞和DNA损伤诱导基因γ（GADD45g）描述为AML中的新型肿瘤抑制因子。研究发现，GADD45g在AML中特异性沉默，尤其在具有FMS样酪氨酸激酶3-内部串联重复（FLT3-ITD）突变和混合谱系白血病（MLL）重排的AML中。GADD45g表达减少与AML患者的预后不良相关。GADD45g的上调损害同源重组DNA修复，导致DNA损伤积累，并显著诱导AML细胞的凋亡、分化和生长停滞，增加对化疗药物的敏感性，而不影响正常细胞。此外，GADD45g在AML中通过组蛋白脱乙酰化被表观遗传沉默，并且其表达进一步受到FLT3-ITD和MLL-AF9等癌基因的下调。组蛋白脱乙酰酶1/2抑制剂罗米地辛与FLT3酪氨酸激酶抑制剂AC220或溴结构域抑制剂JQ1的组合，分别对FLT3-ITD+和MLL-AF9+ AML发挥协同抗白血病作用，通过双重激活GADD45g。这些发现揭示了GADD45g在FLT3-ITD+和MLL-AF9+ AML中的选择性抗白血病作用，并为治疗这些AML提供了新的策略[4]。

Gadd45g/CR6、Gadd45b/MyD118和Gadd45a/Gadd45是GADD45基因家族的成员，它们在应对诱导分化、生长停滞和/或细胞凋亡的刺激时表现出不同的基因表达模式。所有三种高度保守的蛋白质都与多种关键的细胞周期和细胞存活调节蛋白相互作用，如PCNA、p21（WAF1/CIP1）、CDK1（cdc2-p34）和MTK1/MEKK4，并影响p38和JNK激酶的活性。一项研究通过物种印迹分析发现Gadd45g是一个进化上保守的基因，并且序列分析表明Gadd45g的基因结构与家族其他成员相似。对基因家族成员的序列中发现的假设转录因子结合位点的比较分析表明，NF-kappaB和STATs可能负责Gadd45g和Gadd45a之间观察到的表达调控差异。Gadd45b/MyD118启动子的分析表明，存在三个不同的增强子样区域，这可能允许Gadd45b/MyD118启动子对TGF-beta1的细胞类型特异性反应。荧光原位杂交（FISH）证实了Gadd45g基因在鼠染色体13A5-B带的定位，该区域据报道包含一个调节小鼠体重的数量性状位点。这表明Gadd45g基因的等位基因可能在调节体重方面发挥作用，除了其在分化应激反应中的已知作用外[5]。

GADD45G是一个应激反应基因，在多种肿瘤中作为功能性肿瘤抑制因子，其对外部压力的响应经常被表观遗传机制破坏。一项研究使用甲基化敏感代表性差异分析结合5-aza-2'-脱氧胞苷脱甲基化鉴定了GADD45G的CpG岛作为超甲基化基因的靶序列。GADD45G位于9q22的常见缺失区域，是DNA损伤诱导基因家族的成员。在应激冲击下，GADD45G抑制细胞生长并诱导凋亡。与GADD45家族的其他成员一样，GADD45G在所有正常成年和胎儿组织中广泛表达。然而，在肿瘤细胞系中，其转录沉默或下调以及启动子高甲基化被频繁检测到，包括13个非霍奇金淋巴瘤细胞系中的11个（85%）、6个霍奇金淋巴瘤细胞系中的3个（50%）、11个鼻咽癌细胞系中的8个（73%）、4个宫颈癌细胞系中的2个（50%）、17个食管癌细胞系中的5个（29%）和5个肺癌细胞系中的2个（40%）。在永生化正常上皮细胞系、正常组织或外周血单核细胞中未检测到GADD45G的沉默。GADD45G的沉默可以通过5-aza-2'-脱氧胞苷或DNMT1和DNMT3B的双基因敲除来逆转，表明存在直接的表观遗传机制。尽管在原发淋巴瘤中较少，但在原发癌中进一步检测到异常甲基化。在检查的25个细胞系中，仅发现一个单序列变化，表明GADD45G的基因失活非常罕见。GADD45G可以在未甲基化的细胞系中被热休克或紫外线照射诱导；然而，当其启动子发生高甲基化时，这种应激反应被消除。GADD45G的过表达在沉默的细胞系中强烈抑制肿瘤细胞生长和集落形成。这些结果表明，GADD45G可以作为一种新型的功能性肿瘤抑制因子，但在多种肿瘤中经常被表观遗传失活[6]。

Vogt-Koyanagi-Harada（VKH）病是一种严重的自身免疫性疾病。一项研究对2573名对照者和229名VKH患者进行了全外显子测序（WES），并在2380名对照者和2278名VKH患者中进行后续的下一代测序（NGS）。研究发现，在嗅觉受体11H1（OR11H1）基因中存在一个罕见的c.188T>C（p Val63Ala）错义突变，与VKH病显著相关（rs71235604，Pcombined = 7.83 × 10-30 ，优势比 = 3.12）。功能研究表明，OR11H1-A63显著增加了炎症因子的产生并加剧了屏障功能损伤。进一步的研究使用RNA测序发现，OR11H1-A63显著增加了GADD45G的表达。此外，OR11H1-A63激活了MAPK和NF-κB通路，并加速了炎症级联反应。此外，抑制GADD45G可以减轻炎症因子的分泌，这可能是由于GADD45G对MAPK和NF-κB通路的调节作用。总的来说，这项研究表明，OR11H1-A63错义突变可能通过GADD45G依赖性方式增加对VKH病的易感性[7]。

性决定在哺乳动物中由XY胚胎中前列腺素（SRY-SOX9-FGF9）或XX胚胎中抗卵巢（RSPO1-WNT4-FOXL2）遗传通路的显性控制。一项研究表明，早期、robust的Sry表达依赖于核蛋白GADD45g。在缺乏GADD45g的情况下，XY性腺性别反转发生，与11.5 dpc时Sry水平的显著降低相关。研究进一步探讨了Gadd45g和Sry之间的关系，使用增益和功能丧失遗传学。首先，研究显示，在B6.YPOS性别反转模型中，转基因Gadd45g过表达可以提高11.5 dpc时Sry的表达水平，从而实现表型修复。研究还显示，在B6.YPOS和Gadd45g缺乏的XY性腺中，抗卵巢Rspo1的基因型对观察到的性腺性别反转的程度至关重要，与Foxl2相反。在缺乏Gadd45g和Rspo1的XY性腺中观察到性别反转的表型修复，但这并没有伴随11.5 dpc时Sry表达水平的修复。相反，Sox9水平在约12.5 dpc时得到修复。研究得出结论，Gadd45g对XY性腺中Sry的及时表达是绝对必需的，独立于RSPO1介导的WNT信号传导，并讨论了这些数据与我们对抗前列腺素和抗卵巢通路之间拮抗性相互作用的了解[8]。

GADD45G是GADD45家族的一个重要成员，与某些人类癌症的发展有关。一项研究通过生物信息学分析和体内实验，旨在确定GADD45G在肝细胞癌（HCC）中的潜在作用，并分析4-甲氧基达伯格酮（4MOD）对GADD45G表达的调节作用。研究利用公开数据和人源免疫组织化学（IHC）实验来探索GADD45G在HCC样本中的表达特征和临床意义。基于GADD45G共表达基因的功能富集分析被用于挖掘GADD45G在HCC中的分子机制。研究还在BALB/c裸鼠上进行体内实验，以挖掘4MOD对HCC的抑制作用，并评估4MOD处理组和未处理组异种移植组织中GADD45G表达的差异。GADD45G在HCC组织中表现出显著低表达。GADD45G表达下调与HCC患者的一些高风险因素呈正相关，并预测HCC患者的预后较差。GADD45G mRNA表达与免疫细胞密切相关，包括中性粒细胞、NK细胞、CD8 T细胞和巨噬细胞。GADD45G共表达基因参与细胞周期、碳代谢和过氧化物酶体等途径。4MOD可以显著抑制HCC的生长，并且这种抑制作用依赖于GADD45G表达的升高。GADD45G表达可以用作HCC的新临床生物标志物，GADD45G可能是4MOD在肝癌中抗癌作用的潜在靶点[9]。

细菌人工染色体（BACs）为在哺乳动物基因组中操纵基因表达和标记基因产物提供了一种手段，无需改变内源基因结构，并避免产生有害的表型后果。然而，为了使BAC克隆适用于这些目的，必须证明它包含所有必需的调节元件以实现正常的基因表达，并在内源基因缺失的情况下允许表型修复。一项研究报道了鉴定了一个功能性BAC，包含Gadd45g基因，该基因与DNA修复、DNA去甲基化和小鼠的睾丸决定有关，并且在胚胎中表现出广泛的表达模式。缺乏内源性Gadd45g基因的鼠胎在存在Gadd45g BAC转基因的情况下经历正常的睾丸发育。此外，对来自BAC的胚胎Gadd45g表达的检查表明，所有报道的表达位点都得到保留。这个功能性BAC现在可以用于后续操纵Gadd45g基因，有信心其包含胚胎表达所需的调节元件，包括睾丸决定。研究描述了Gadd45g-mCherry荧光报告基因的构建和表征，该基因在发育中的性腺和神经组织中表现出强烈的表达，复制了内源性基因的表达，作为这一点的证据[10]。

综上所述，GADD45g基因在多种生物学过程中发挥着重要作用，包括细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞凋亡和性决定。GADD45g基因的异常表达和功能丧失可能与多种疾病的发生和发展有关，包括非酒精性脂肪肝疾病、阿尔茨海默病、急性髓细胞性白血病、肾小管细胞凋亡和肝细胞癌等。因此，GADD45g基因可能成为治疗这些疾病的重要靶点。未来的研究需要进一步探讨GADD45g基因在不同疾病中的作用机制，并开发基于GADD45g基因的治疗策略，以提高疾病的治疗效果。