Tox-KO 基因敲除小鼠

TOX是一种核内高迁移率族（HMG）框转录因子，它属于一个在进化上保守的DNA结合蛋白家族。TOX编码一种核蛋白，属于高迁移率族框超家族，它包含一个DNA结合域，允许它通过改变局部染色质结构和调节多蛋白复合物的形成来调节转录。TOX在免疫系统中发挥着重要作用，特别是在T细胞分化、发育和功能方面。

TOX在肿瘤特异性T细胞分化中起着关键作用。研究发现，TOX在肿瘤特异性T细胞（TST）中高度表达，并且在慢性病毒感染中的耗竭T细胞中也同样表达。TOX的表达受慢性T细胞受体刺激和NFAT激活的驱动。体外实验表明，TOX的过表达会导致T细胞耗竭相关的转录程序。相反，在肿瘤中敲除Tox基因会消除耗竭程序，敲除Tox的TST细胞不会上调抑制性受体基因，并且保留了高水平的转录因子如TCF-1的表达。尽管它们的表型正常，"非耗竭"，但敲除Tox的TST细胞仍然功能失调，这表明抑制性受体的表达调控与效应功能的丧失是解耦的。此外，尽管敲除Tox的CD8 T细胞在急性感染中可以正常分化为效应细胞和记忆细胞，但敲除Tox的TST细胞在肿瘤中无法持久存在。研究者假设，TOX诱导的耗竭程序旨在防止在慢性抗原刺激如癌症中T细胞的过度刺激和激活诱导的细胞死亡[1]。

TOX转录因子和表观遗传程序CD8+ T细胞耗竭。耗竭的CD8+ T（Tex）细胞在慢性感染和癌症中具有有限的效应功能，高共表达抑制性受体和与效应（Teff）或记忆（Tmem）CD8+ T细胞相比具有广泛的转录变化。Tex细胞是检查点阻断和其他免疫疗法的重要临床目标。表观遗传上，Tex细胞是独特的免疫亚群，与Teff和Tmem细胞相比，具有独特的染色质景观。然而，目前尚不清楚控制Tex细胞转录和表观遗传发育的机制。研究发现，HMG框转录因子TOX是小鼠中Tex细胞的关键调节因子。TOX对于形成Teff和Tmem细胞来说是多余的，但对于耗竭是至关重要的：在缺乏TOX的情况下，Tex细胞不会形成。TOX由钙调神经磷酸酶和NFAT2诱导，并在Tex细胞中形成一个正反馈回路，其中它变得独立于钙调神经磷酸酶并持续存在。因此，TOX的强表达导致了对Tex细胞的承诺，通过将持续的刺激转化为独特的Tex细胞转录和表观遗传发育程序[2]。

TOX基因是人类癌症基因治疗的新靶点。TOX编码一个核蛋白，属于高迁移率族框超家族，它包含一个DNA结合域，允许它通过改变局部染色质结构和调节多蛋白复合物的形成来调节转录。TOX在免疫系统中发挥着重要作用，并在多种免疫相关细胞亚群中表达。最近的研究表明，TOX的表达在多种类型的人类肿瘤中经常上调，并且过度表达通常与肿瘤进展相关。此外，TOX还参与控制细胞凋亡、生长、转移、DNA修复等过程[3]。

TOX在耗竭和多功能人类效应记忆CD8+ T细胞中表达。CD8+ T细胞耗竭是许多癌症和慢性感染的标志。在老鼠中，T细胞因子1（TCF-1）维持耗竭CD8+ T细胞反应，而胸腺细胞选择相关HMG框（TOX）对于耗竭CD8+ T细胞的表观遗传重塑和存活是必需的。然而，这些转录因子在人类中的作用尚不清楚。研究发现，循环TOX+ CD8+ T细胞存在于大多数人类中，但TOX并不与耗竭有关。效应记忆CD8+ T细胞通常表达TOX，而幼稚和早期分化的记忆CD8+ T细胞通常表达TCF-1。细胞毒性基因和蛋白表达特征也由TOX的表达定义。在持续的免疫挑战背景下，耗竭的HIV特异性CD8+ T细胞通常表达TOX，通常与各种激活标记和抑制性受体聚集在一起，并且表达较少的TCF-1。然而，针对巨细胞病毒（CMV）或EB病毒（EBV）的多功能记忆CD8+ T细胞也表达TOX，无论是否与TCF-1一起表达。在维持对病毒复制异常免疫控制的个体中，针对HIV的CD8+ T细胞也观察到类似的现象。这些数据共同表明，TOX在大多数循环效应记忆CD8+ T细胞亚群中表达，并且与耗竭没有独特的联系[4]。

TOX通过防止PD1降解来促进抗肿瘤CD8+ T细胞的耗竭。TOX在T细胞发育和分化中发挥着重要作用，然而，它在T细胞耗竭中的作用尚未被探索。研究发现，TOX在肝细胞癌中耗竭的CD8+ T细胞中上调表达。在CD8+ T细胞中下调TOX的表达抑制了肿瘤生长，增加了CD8+ T细胞的浸润，减轻了CD8+ T细胞的耗竭，并提高了CD8+ T细胞对抗PD1反应。TOX在细胞质中与PD1结合，促进了PD1的内吞再循环，从而在细胞表面保持了丰富的PD1表达。外周CD8+ T细胞中TOX的高表达与较差的抗PD1反应和预后相关。TOX通过调节PD1的内吞再循环来促进肝细胞癌中CD8+ T细胞的耗竭。下调CD8+ T细胞中TOX的表达与抗PD1疗法具有协同作用，突出了癌症免疫治疗的有希望策略[5]。

TOX和TOX2转录因子与NR4A转录因子协同作用以促进CD8+ T细胞耗竭。T细胞表达嵌合抗原受体（CAR T细胞）对白血病和淋巴瘤显示出令人印象深刻的疗效。然而，它们对实体肿瘤的效果并不理想，因为它们在肿瘤微环境中变得低反应性（"耗竭"或"功能障碍"），细胞因子产生减少，抑制性表面受体表达增加。研究发现，HMG框转录因子TOX和TOX2以及NR4A家族的核受体成员是钙/钙调神经磷酸酶调节转录因子NFAT的靶点，即使在缺乏其伴侣AP-1（FOS-JUN）的情况下也是如此。使用先前建立的CAR T细胞模型，研究发现TOX和TOX2在CD8+ CAR+ PD-1high TIM3high（"耗竭"）肿瘤浸润淋巴细胞（CAR TILs）中高度诱导，缺乏TOX和TOX2的CAR TILs（Tox DKO）比野生型（WT）、TOX缺陷或TOX2缺陷的CAR TILs更能有效地抑制肿瘤生长并延长肿瘤携带小鼠的存活时间。与NR4A缺陷的CAR TILs一样，Tox DKO CAR TILs表现出细胞因子表达增加，抑制性受体表达减少，富含与激活相关核因子κB（NFκB）和碱性区域亮氨酸拉链（bZIP）转录因子结合位点的区域可及性增加。这些数据表明，Tox和Nr4a转录因子是NFAT下游CD8+ T细胞耗竭转录程序的关键。研究提供了TOX对NR4A的正向调节和NR4A对TOX的调节的证据，并建议破坏TOX和NR4A的表达或活性可能是癌症免疫治疗的很有前景的策略[6]。

TOX基因编码两种具有不同和共享作用的基因调节蛋白。研究发现，小鼠Tox基因从单个mRNA编码两种蛋白，并研究了这些蛋白的产生和功能机制。预测的胸腺细胞选择相关HMG框蛋白（TOX）编码序列会产生一个526-aa蛋白（TOXFL）。然而，Western印迹揭示有两个条带。研究发现，较低条带由TOX的N端截断变体（TOXΔN）组成，而较慢迁移的条带是TOXFL。TOXΔN蛋白形式是通过从注释翻译起始位点下游的进化上保守的翻译起始位点进行漏翻译扫描产生的。当从cDNA在鼠CD8 T细胞或HEK细胞中异源表达，或从鼠Tox位点内源表达时，这两种形式都会被翻译，尽管TOXFL/TOXΔN的比率随着细胞环境的显著变化。这包括在鼠CD4 T细胞在胸腺中的发育过程中TOX蛋白总量和TOXΔN产生的增加，其中CD4+CD8+细胞的阳性选择和随后分化为CD4+CD8lo转换和CD4SP细胞亚群相关。最后，研究发现，仅表达TOXFL在模仿耗竭的慢性刺激下对基因调节的影响大于TOXΔN，包括独特调节的细胞周期和其他基因[7]。

TOX在早期皮质发育中的作用。哺乳动物大脑皮层的早期发育是通过一系列从神经干细胞到神经元和神经胶质细胞的增殖和分化步骤进行的。然而，这些步骤是如何在分子水平上协调的仍然只有部分了解。研究发现，TOX，一个之前只知道在淋巴细胞发育中起作用的HMG框转录因子，在早期皮质发育中发挥作用[8]。

白喉毒素和tox基因的生物学和分子流行病学。白喉毒素（DT）是白喉杆菌的胞外蛋白，可抑制蛋白质合成并杀死易感细胞。编码DT的基因（tox）存在于一些白喉噬菌体中，并且只有携带tox+噬菌体的白喉杆菌分离株才会产生DT。白喉毒素抑制因子（DtxR）是一种使用Fe2+作为辅阻遏物的全局调节蛋白。全DtxR抑制DT、白喉杆菌铁载体、血红素加氧酶和其他几种蛋白质的产生。用于检测C. diphtheriae毒素产生性的诊断测试要么基于免疫测定，要么基于DT的生物测定。对tox和dtxR基因在最近C. diphtheriae临床分离株中的分子分析揭示了编码相同DT蛋白的几个tox等位基因和编码五种DtxR蛋白变体的多个dtxR等位基因。因此，最近C. diphtheriae临床分离株产生一种抗原型的DT，并且白喉类毒素仍然是预防白喉的有效疫苗[9]。

综上所述，TOX是一种重要的转录因子，在T细胞分化、发育和功能中起着关键作用。TOX在肿瘤特异性T细胞分化、耗竭和多功能人类效应记忆CD8+ T细胞中表达，并参与调节PD1表达和内吞再循环。TOX与NR4A转录因子协同作用以促进CD8+ T细胞耗竭。此外，TOX在早期皮质发育中发挥作用。TOX的研究有助于深入理解T细胞耗竭的机制和肿瘤免疫治疗的策略。