Snapin-KO 基因敲除小鼠

基因Snapin是一种细胞内蛋白，它在多种细胞过程中发挥关键作用。Snapin是SNARE复合物（可溶性NSF附着蛋白受体）的一个组成部分，这个复合物在细胞内囊泡运输和膜融合过程中至关重要。此外，Snapin还参与了BLOC-1复合物的形成，BLOC-1复合物在细胞器运输和细胞内稳态中发挥作用。Snapin的功能不仅限于囊泡运输和膜融合，它在多种生物学过程中都有重要作用，包括细胞周期调控、细胞增殖、胰岛素分泌、自噬、神经元生长和病毒感染等。

Snapin在细胞周期调控和细胞增殖中发挥作用。研究发现，Snapin的表达随着小鼠年龄的增长而增加，在糖尿病中则下调。KEGG通路和GO分析显示，与Snapin相互作用的蛋白在细胞周期调控中富集。当Snapin表达下调时，B细胞周期在S期被阻滞，细胞增殖受到抑制。细胞周期中S期CDK2、CDK4和CCND1蛋白的表达在Snapin下调后降低，而在Snapin过表达后升高。此外，胰岛素蛋白和mRNA水平在Snapin下调或过表达后也相应地降低或升高。这些数据表明，Snapin介导β细胞增殖和胰岛素分泌，可能是糖尿病的药物治疗的靶点[1]。

Snapin在巨噬细胞中发挥重要作用。研究发现，Snapin在类风湿性关节炎滑膜组织巨噬细胞中高度表达，但其作用尚不清楚。使用siRNA沉默Snapin的表达导致溶酶体肿胀和CTSD（组织蛋白酶D）激活受损，尽管总CTSD水平没有降低。内体货物递送或溶酶体与内体或自噬体的融合在强制沉默Snapin后并没有被抑制。Snapin沉默细胞的溶酶体酸化和自噬体积累受到抑制，导致不完全的溶酶体水解和自噬/自噬通量受损。机制研究表明，Snapin的减少导致H+泵活性略有下降，但更关键的是溶酶体质子泄漏。总体而言，这些结果表明Snapin在维持健康的溶酶体和自噬中起着至关重要的作用，这主要通过对溶酶体酸化和自噬体成熟的作用来防止质子泄漏。这些观察结果表明Snapin和自噬在巨噬细胞稳态中起着重要作用，特别是对于寿命长的组织驻留巨噬细胞[2]。

Snapin在神经元中也发挥重要作用。研究发现，血清剥夺导致细胞内DYRK3水平通过蛋白水解自噬途径下降，同时抑制DYRK3基因表达。为了进一步证明DYRK3如何影响细胞活力，特别是在神经元中，研究者使用酵母双杂交实验发现多个DYRK3结合蛋白，包括Snapin，这是一个与突触传递有关的SNARE相关蛋白。还发现DYRK3直接在Thr 14残基处磷酸化Snapin，增加Snapin与其他蛋白（如动力蛋白和突触结合蛋白-1）的相互作用。在神经系统中，Snapin与动力蛋白介导的线粒体逆向运输和SNARE复合物介导的突触囊泡的胞吐作用有关。此外，Thr-14处Snapin的磷酸化被发现可以正调节线粒体逆向运输，并增加突触囊泡的再循环池大小，从而有助于神经元活力。这项研究显示，DYRK3磷酸化Snapin，正调节动力蛋白介导的线粒体逆向运输和神经元内突触囊泡的SNARE复合物介导的胞吐作用。这一发现进一步表明DYRK3影响细胞活力，并提供了一种新的神经保护机制[3]。

Snapin在神经元生长和突触传递中也发挥重要作用。研究发现，Snapin作为动力蛋白的适配器，介导TrkB信号内体的逆向轴突运输。这种作用对皮质神经元的树突生长至关重要。删除snapin或破坏Snapin-动力蛋白相互作用消除了TrkB逆向运输，阻碍了BDNF诱导的从轴突末端到细胞核的逆向信号传导，并降低了树突生长。这些缺陷通过重新引入snapin基因得到挽救。这项研究揭示了Snapin-动力蛋白耦合是驱动BDNF-TrkB逆向运输的主要机制之一，从而为神经元生长和生存的调节提供了机制上的见解[4]。

Snapin在自身免疫性疾病中也发挥重要作用。研究发现，在类风湿性关节炎（RA）滑膜组织中，Snapin是TLR2的内源性配体。通过酵母双杂交cDNA文库构建和筛选，发现Snapin与TLR2相互作用。通过免疫组织化学和定量逆转录PCR，发现Snapin在RA滑膜组织中高度表达，并在巨噬细胞中检测到，其中与晚期内体共定位。Snapin在RA滑膜组织中的表达与炎症相关，并非疾病特异性。此外，Snapin能够通过TLR2激活。这些观察结果将Snapin确定为RA中的一种新型内源性TLR2配体，从而支持了持续TLR2信号传导在RA发病机制中的作用[5]。

Snapin在神经退行性疾病中也发挥重要作用。研究发现，LRRK2是导致常染色体显性家族性帕金森病（PD）的基因。酵母双杂交筛选显示，Snapin，一种与SNAP-25相互作用的蛋白，与LRRK2相互作用。体外激酶实验表明，Snapin被LRRK2磷酸化。GST pull-down实验表明，LRRK2可能通过其Ras-of-complex（ROC）和N端结构域与Snapin相互作用，与Snapin与LRRK2野生型（WT）或其致病突变体的相互作用没有显著差异。进一步分析突变研究表明，Snapin的苏氨酸117是LRRK2磷酸化的一个位点。此外，Snapin T117D磷酸化模拟突变体在GST pull-down实验中降低了其与SNAP-25的相互作用。SNAP-25是SNARE（可溶性NSF附着蛋白受体）复合物的一个组成部分，对突触囊泡的胞吐作用至关重要。用重组Snapin T117D蛋白与大鼠脑裂解物孵育，而不是WT蛋白，导致突触素与SNARE复合物的相互作用降低。在背侧海马神经元中，LRRK2依赖性Snapin的磷酸化导致可释放囊泡的数量减少和胞吐释放的程度降低。这些数据表明，LRRK2可能通过控制Snapin的功能来调节神经递质的释放，通过抑制性磷酸化[6]。

Snapin在阿尔茨海默病（AD）中也发挥重要作用。研究发现，β位点淀粉样前体蛋白（APP）切割酶1（BACE1）是生成β-淀粉样（Aβ）肽的主要β分泌酶。内体的酸性环境是β分泌酶活性最适宜的。然而，BACE1从内体到溶酶体进行降解的机制尚不清楚。使用snapin缺陷小鼠和基因挽救实验，发现Snapin作为晚期内体的动力蛋白马达适配器，介导BACE1逆向运输。hAPP突变体活神经元和小鼠脑中BACE1在内体改变和溶酶体靶向缺陷的晚期内吞体中积累，这是由于Snapin-动力蛋白耦合减少。删除snapin或破坏Snapin-动力蛋白耦合降低了BACE1向溶酶体的运输以进行降解，从而增强了APP的加工。在hAPP神经元中过表达Snapin降低了APP的β位点切割，通过增强BACE1的周转。总的来说，这项研究提供了关于BACE1水平和活性以及周转的复杂调节机制的见解，通过逆向运输控制神经元中的Aβ生成[7]。

Snapin还与晚期内体有关。研究发现，晚期内体膜转运将目标材料和新生成的水解酶送入溶酶体，这对于维持有效的降解过程和细胞稳态至关重要。尽管已经描述了一些晚期内体-溶酶体转运的特征，但调节这一事件的机制仍有待阐明。以前的研究表明，Snapin作为一种SNAP25（25 kDa突触体相关蛋白）结合蛋白，在神经元中同步融合突触囊泡的启动中起着关键作用。在目前的研究中，报告Snapin还与晚期内体膜性细胞器相关，并与晚期内体靶向SNARE（可溶性N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）复合物相互作用。使用基因小鼠模型，进一步发现Snapin对于维持晚期内体蛋白LAMP-1（溶酶体相关膜蛋白-1）和晚期内体SNARE蛋白 syntaxin 8和Vti1b（通过靶SNAREs相互作用进行囊泡转运的同源物1b）的适当平衡是必需的。在小鼠中删除snapin基因选择性地导致这些蛋白在晚期内体细胞器中积累。因此，目前的研究表明，Snapin除了在调节突触囊泡融合中已建立的调节作用外，还作为晚期内体融合机制的调节因子发挥着重要作用[8]。

Snapin还与GLUT4转运有关。研究发现，外排体是一种多亚基复合物，被认为在从高尔基体到质膜的囊泡运输中起作用，可能作为囊泡锚定物，并可能有助于膜融合的特异性。在这里，描述了外排体Exo70亚基与Snapin之间的一种新型相互作用，Snapin是一种普遍存在的蛋白质，已知与至少两种t-SNAREs，SNAP23和SNAP25相关。Exo70和Snapin之间的相互作用是通过Exo70的N端螺旋-螺旋结构域和Snapin的C端螺旋结构域介导的。Exo70与SNAP23竞争Snapin的结合，表明Snapin并不直接为外排体和SNARE复合物之间提供直接联系，而是通过顺序相互作用介导两者之间的交叉对话。胰岛素调节GLUT4向质膜的转运，以促进脂肪细胞中的葡萄糖摄取，SNAP23和外排体都参与了这个过程。在这项研究中，使用RNA干扰在脂肪细胞中耗尽Snapin抑制了胰岛素刺激的葡萄糖摄取。因此，Snapin与外排体相互作用，并在GLUT4囊泡转运中起调节作用[9]。

Snapin还与病毒感染有关。研究发现，猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）以妊娠母猪的流产和幼猪的呼吸道疾病为特征。致病因素是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），是动脉病毒家族的一员。GP5和M是PRRSV编码的主要包膜蛋白。为了进一步表征这两种病毒蛋白，使用酵母双杂交方法来鉴定PRRSV GP5和M蛋白的相互作用伴侣。使用猪巨噬细胞cDNA文库酵母双杂交筛选来鉴定PRRSV GP5/M的相互作用伴侣。随后，使用截短的GP5和M蛋白在酵母双杂交实验中映射PRRSV GP5/M与细胞蛋白Snapin之间的相互作用。从非洲绿猴肾细胞系MARC-145，即对PRRSV有利的细胞系中克隆和测序了Snapin基因，并与猪Snapin进行了比较。使用针对Snapin的特异性siRNA靶向，发现PRRSV感染细胞中的细胞Snapin表达减少。在这里，展示了细胞Snap-结合蛋白（Snapin），SNARE膜融合网络的辅助蛋白，也是BLOC-1复合物的一个成员，与GP5和M特异性相互作用。通过siRNA靶向Snapin的表达抑制导致PRRSV复制减少。PRRSV GP5和M蛋白已知形成一种异源二聚体复合物，这对病毒结构和感染性很重要，这两种PRRSV蛋白都能与细胞Snapin相互作用。Snapin敲低表明这些相互作用可能在PRRSV生命周期中很重要。GP5和M蛋白可能通过与Snapin相互作用来利用其在细胞内运输和膜融合中的作用[10]。

综上所述，基因Snapin在多种生物学过程中发挥着重要作用，包括细胞周期调控、细胞增殖、胰岛素分泌、自噬、神经元生长、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、病毒感染等。Snapin的研究有助于深入理解细胞内囊泡运输、膜融合和细胞内稳态的调节机制，为多种疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。