Hunk-flox 基因敲除小鼠

HUNK基因，也称为Hormonally Upregulated Neu-associated Kinase，是一种与腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）家族相关的丝氨酸/苏氨酸（S/T）蛋白激酶。该基因最初是通过筛选小鼠乳腺中表达的激酶而被发现的，因此迄今为止的大多数研究都是在特定于该组织的模型中进行的。HUNK基因的名称反映了其在乳腺生理和病理中的特异性。HUNK基因在乳腺癌中具有明确的致病作用，它在HER2/neu和Akt的致癌作用下被上调，并且有强有力的证据表明HUNK对于乳腺癌细胞的生存至关重要。进一步的研究表明，使用各种乳腺癌模型（包括那些耐药的）抑制HUNK可以抑制肿瘤发生和转移。然而，HUNK基因的变异并不频繁[1]。

缺氧是癌症的一个常见标志，在促进上皮-间质转化（EMT）中起着关键作用。HUNK通过其激酶活性调节EMT。缺氧并不改变HUNK的表达水平，但直接影响下游蛋白的磷酸化水平，这表明HUNK的活性。在缺氧条件下，结直肠癌细胞迁移、侵袭和EMT标志物的上调部分归因于HUNK介导的下游蛋白磷酸化的下调。这些发现突出了HUNK、缺氧和癌症EMT分子机制之间的复杂关系。了解这些机制可能为抑制癌症转移的治疗靶点提供有价值的见解[2]。

三阴性乳腺癌（TNBC）缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达。TNBC肿瘤对内分泌治疗不敏感，并且缺乏标准化的TNBC治疗方案。TNBC是一种更具免疫原性的乳腺癌亚型，使其对免疫治疗干预更为敏感。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是TNBC肿瘤中最丰富的免疫细胞群体之一，并有助于癌症转移。该研究检查了蛋白激酶HUNK在肿瘤免疫中的作用。使用NanoString的nCounter PanCancer Immune Profiling面板进行的基因表达分析发现，靶向HUNK与IL-4/IL-4R细胞因子信号通路的变化相关。实验分析表明，HUNK激酶活性调节乳腺肿瘤细胞中的IL-4产生，并且这种调节依赖于STAT3。此外，HUNK依赖性调节肿瘤细胞分泌的IL-4导致巨噬细胞极化为与TAMs相关的M2样表型。反过来，IL-4诱导癌症转移和巨噬细胞产生表皮生长因子。这些发现描述了由HUNK调节并由IL-4/IL-4R依赖的肿瘤细胞和TAMs之间的旁分泌信号交换。这突出了HUNK作为减少TNBC转移的潜在靶点，通过调节TAMs群体[3]。

在肠细胞增殖中，Hunk/Mak-v起负调节作用。在Apc基因在小鼠肠道中条件性缺失导致急性Wnt信号激活的情况下，Hunk/Mak-v/Bstk1基因被推断为可能发挥重要作用的候选基因。Hunk是一种与多种不同肿瘤类型相关的SNF1（蔗糖非发酵1）相关丝氨酸/苏氨酸激酶，包括结直肠癌。在这里，我们描述了一种新的Hunk激酶缺陷小鼠的生成，用于研究Hunk激酶活性在肠道稳态和肿瘤发生中的作用。我们表明，在形态学正常的肠道中，Hunk激酶负调节上皮细胞增殖。然而，在Hunk激酶缺陷的肠道中观察到的细胞增殖增加被细胞迁移的增加所抵消，从而维持肠道稳态。使用qRT-PCR，我们进一步证明，Hunk在Apc缺陷/Wnt信号激活的肠道组织中显著过表达。使用经典的肠道肿瘤发生Apc（Min）小鼠模型，我们发现Hunk激酶活性的丧失显著降低了小肠的肿瘤启动率。然而，肿瘤大小的增加抵消了这对总体肿瘤负担或随后的生存的影响。在肠道环境中，我们证明Hunk在正常的肠道增殖和稳态中发挥作用，尽管它不会改变总体的生存率，但该激酶的活性确实会影响小肠肿瘤发生早期阶段的肿瘤启动率[4]。

MAK-V/Hunk在肾脏远端小管中的表达及其在增殖抑制中的作用。MAK-V/Hunk是一种SNF1相关的丝氨酸/苏氨酸激酶，先前已被证明在乳腺和中枢神经系统中高度表达。在这项研究中，我们发现MAK-V/Hunk在从胚胎阶段到成年阶段的肾脏的厚上升支和远曲小管（DCT）中丰富且特异性表达。我们证明，与正常盐饮食相比，饮食盐耗尽显著增强了肾脏MAK-V/Hunk mRNA水平。为了分析该激酶在肾脏细胞功能中的作用，我们使用了小鼠远曲小管（mDCT）细胞。反转录聚合酶链反应和蛋白质印迹分析的结果显示，MAK-V/Hunk在mDCT细胞中内源表达。通过腺病毒基因转移过表达MAK-V/Hunk显著抑制了ANG II诱导的c-fos基因转录的刺激，并抑制了ANG II介导的转化生长因子-β产生到培养基中。这种现象伴随着ANG II诱导的BrdU掺入的抑制。另一方面，通过siRNA敲低MAK-V/Hunk激活了ANG II诱导的c-fos基因表达。在连续的MAK-V/Hunk和AT(1)受体染色的切片中，MAK-V/Hunk免疫阳性远端小管表达了AT(1)受体。这是关于MAK-V/Hunk在肾脏内的定位及其在肾脏小管细胞中的细胞功能的首次报道[5]。

Snf1相关激酶Hunk对于乳腺肿瘤转移是必需的。我们从MMTV-neu转基因小鼠中产生的乳腺肿瘤中鉴定出了一种Snf1/AMPK相关蛋白激酶Hunk。该激酶的功能尚不清楚。使用小鼠中的靶向删除，我们现在证明Hunk对于c-myc诱导的乳腺肿瘤的转移是必需的，但对正常发育是可有可无的。重建实验表明，Hunk足以恢复Hunk缺陷肿瘤细胞的转移潜力，以及迁移和侵袭缺陷，并且这种方式需要其激酶活性。与该激酶在人类癌症进展中的作用一致，Hunk的人类同源物在卵巢、结肠和乳腺的侵袭性癌中过表达。此外，区分Hunk野生型和Hunk缺陷乳腺肿瘤的murine基因表达特征预测了乳腺癌患者的临床结果，这与Hunk在小鼠中促进转移的功能一致。这些发现确定Hunk激酶活性在转移中的直接作用，并为该激酶建立了体内功能[6]。

Hunk对于HER2/neu诱导的乳腺肿瘤发生是必需的。了解导致人类癌症侵袭性行为的分子途径是关键的研究重点。SNF1/AMPK相关蛋白激酶Hunk在人类乳腺、卵巢和结肠癌的侵袭性亚型中过表达。对Hunk（-/-）小鼠的分析表明，这种激酶对于c-myc诱导的乳腺肿瘤的转移是必需的，但不是c-myc诱导的原发性肿瘤形成。与c-myc类似，原癌基因HER2/neu的扩增发生在10%至30%的乳腺癌中，并与侵袭性肿瘤行为相关。通过将Hunk（-/-）小鼠与HER2/neu诱导的乳腺肿瘤发生转基因小鼠模型杂交，我们报告了Hunk对于HER2/neu诱导的原发性肿瘤形成是必需的。在鼠和人类乳腺癌细胞系中的敲低和重建实验表明，Hunk对于维持HER2/neu转化细胞的肿瘤发生表型是必需的。这种需要是激酶依赖性的，并且是由于Hunk与下调肿瘤抑制因子p27(kip1)相关的抑制凋亡的能力。此外，我们发现Hunk在体内和体外HER2/neu激活后迅速上调。这些发现提供了我们认为的第一个证据，表明Hunk在原发性肿瘤发生和细胞生存中发挥作用，并将这种激酶确定为HER2/neu致癌通路的必需效应因子[7]。

Hunk是一种新型哺乳动物Snf1相关蛋白激酶的克隆和特征。我们之前通过设计用于分离小鼠乳腺中表达的激酶的简并PCR筛选，鉴定了一种新型蛋白激酶Hunk。我们现在描述了该激酶的分子克隆、染色体定位和活性，并分析了其在小鼠中的空间和时间表达模式。我们已经分离了一个5.0-kb全长cDNA克隆，其中包含编码Hunk的714个氨基酸开放阅读框。对该cDNA的分析表明，Hunk与SNF1家族的丝氨酸/苏氨酸激酶最密切相关，并包含一个新描述的SNF1同源域。因此，针对Hunk的特异性抗血清检测到一个与磷酸转移酶活性相关的80-kDa多肽。Hunk位于小鼠16号染色体远端，与人类21q22染色体区域保守的同线性区域一致。在胎鼠和成年小鼠中，Hunk mRNA表达是发育调节和组织特异性的。此外，原位杂交分析表明，Hunk在成年小鼠的多种器官中特定细胞亚群中的表达受到限制。这些发现表明，Hunk在鼠类发育中发挥作用[8]。

Hunk通过抑制c-myc促进Akt介导的细胞存活和由Pten缺失引起的乳腺肿瘤发生。原癌基因Akt和c-myc均积极调节细胞生长和增殖，但对细胞存活有相反的影响。这些原癌基因合作促进肿瘤发生，部分原因是Akt的促生存作用抵消了c-myc的促凋亡作用。Akt能够抵消c-myc促凋亡作用的能力主要归因于Akt诱导的促生存途径的刺激，这些途径间接对抗c-myc的作用。我们报告了一个更直接的机制，Akt通过该机制调节c-myc的促凋亡作用。具体来说，我们证明Akt上调腺苷酸活化激酶（AMPK）相关蛋白激酶Hunk，Hunk作为Akt促生存信号的效应因子，通过抑制c-myc表达以激酶依赖性方式，使其达到与细胞存活相兼容的水平。因此，在Hunk（-/-）小鼠的乳腺中激活Akt通路会导致c-myc表达水平升高，从而诱导凋亡。c-myc敲低可以挽救Hunk缺失细胞中Akt激活诱导的凋亡增加，这表明抑制c-myc是Hunk介导Akt促生存作用的主要机制。与这种作用机制一致，我们发现Hunk对于Pten缺失小鼠中的c-myc抑制和乳腺肿瘤发生是必需的。我们的发现建立了Hunk在肿瘤发生中的促生存功能，定义了Akt抑制c-myc诱导凋亡的必需机制，并确定了Hunk作为Akt和c-myc致癌途径之间之前未认识到的联系[9]。

HUNK通过调节细胞存活介导乳腺癌对HER2抑制剂的耐药性。HER2阳性的乳腺癌患者接受针对HER2的靶向抑制剂，包括曲妥珠单抗和拉帕替尼。虽然患者从HER2抑制剂的使用中受益，但许多人治疗失败，几乎所有患者最终都对治疗产生耐药性，这表明迫切需要预防治疗失败。几项最近的研究表明，自噬的激活有助于曲妥珠单抗和拉帕替尼的耐药性，并证明在乳腺癌细胞中损害自噬具有治疗益处。此外，自噬与凋亡途径在信号通路交叉对话方面机制性地相关，其中激活一个过程会影响另一个过程。因此，了解控制这些过程的分子机制可能揭示新的治疗干预领域，以对抗或预防乳腺癌中的耐药性。我们之前描述了蛋白激酶HUNK作为HER2/neu诱导的乳腺肿瘤模型中的乳腺癌促进因子，其中HUNK支持HER2/neu阳性肿瘤细胞的存活，可能通过调节凋亡。由于凋亡和自噬蛋白之间存在显着的交叉对话，我们现在使用对HER2抑制剂敏感和耐药的乳腺癌模型检查HUNK是否也能够通过调节自噬来调节细胞存活。此外，我们研究了抑制HUNK是否会损害由HER2抑制剂耐药性乳腺癌细胞启动的体内肿瘤生长。我们的发现表明，靶向HUNK的治疗是一种克服耐药性的潜在策略，并且耐药性乳腺癌细胞维持HUNK表达以驱动肿瘤发生，这与该激酶的促生存作用一致[10]。

综上所述，HUNK基因是一种重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，在乳腺癌的发生和转移中起着关键作用。HUNK基因的激活与HER2/neu和Akt信号通路的激活密切相关，并且HUNK基因的表达上调与乳腺癌细胞的生存和耐药性有关。进一步的研究表明，HUNK基因通过调节细胞凋亡和自噬途径来促进乳腺癌细胞的存活，并且HUNK基因的表达与乳腺癌患者的临床预后相关。此外，HUNK基因的激活与缺氧条件下的上皮-间质转化（EMT）有关，这可能是HUNK基因在乳腺癌转移中的作用机制之一。HUNK基因的激活还与肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的极化和乳腺癌的免疫逃逸有关，这可能是HUNK基因在乳腺癌免疫治疗中的作用机制之一。因此，HUNK基因是乳腺癌治疗和预防的重要靶点，未来的研究需要进一步探索HUNK基因的生物学功能和分子机制，以开发更有效的治疗方法。