Gprc6a-flox 基因敲除小鼠

GPRC6A，全称G蛋白偶联受体C族第6成员A，是一种广泛表达的G蛋白偶联受体。GPRC6A被提议是复杂内分泌网络和代谢过程的主调节因子。GPRC6A被多种配体激活，包括骨钙素（Ocn）、睾酮（T）、碱性氨基酸和各种阳离子。GPRC6A在小鼠中整合代谢功能，通过协调激素的分泌，包括胰岛素、GLP-1、睾酮和IL-6，以及该受体对肝脏、骨骼肌和脂肪的直接作用来控制葡萄糖和脂肪代谢。GPRC6A缺失导致代谢综合征（MetS），而GPRC6A的激活刺激β细胞增殖，增加外周胰岛素敏感性，并在大多数小鼠模型中保护免受高脂肪饮食（HFD）引起的代谢异常。在骨、心血管、免疫和皮肤功能方面，GPRC6A在鼠标中也有表现。GPRC6A在前列腺癌（PCa）细胞中的表达增加，抑制GPRC6A可以减轻小鼠模型中PCa的进展。然而，GPRC6A在人类中的功能尚不清楚。在进化过程中，GPRC6A出现了一种独特的多态性，主要在亚洲和欧洲人中发现，这种多态性可能改变膜转运和功能。相比之下，所有其他物种中发现的祖先等位基因在亚洲、欧洲和非洲人中的比例分别为1%、15%和40%，这表明GPRC6A基因变异可能对发展MetS和PCa的种族差异有所贡献。如果GPRC6A在老鼠中确定的调节功能在人类中得以实现，并且GPRC6A的基因多态性被证明可以预测人类疾病中的种族差异，那么GPRC6A可能成为预测、预防和治疗MetS、PCa和其他受GPRC6A影响的疾病的新基因靶标[1]。

骨钙素（Ocn）通过其假设的受体GPRC6A作用于Leydig细胞，刺激睾酮（T）的产生，与下丘脑-垂体-性腺轴（HPG）通过促黄体生成激素（LH）介导。为了评估血清未羧化骨钙素（ucOCN）、GPRC6A基因rs2247911多态性和内分泌/精液模式之间的关联，研究人员进行了一项横断面研究。190名男性，包括74名少精症受试者，58名无精症患者和58名正常精子对照受试者，于2018年7月至2020年6月在叙利亚东方医院不孕症、辅助生殖和遗传学研究中心（研究编号18FP）进行了前瞻性招募。门诊评估包括临床病史、人体测量学和空腹血液采样以检测激素、血清骨钙素（羧化和未羧化）、血糖和血脂谱以及rs2247911 GPRC6A基因多态性的筛选。较高的血清ucOCN与较高的睾酮和HDL胆固醇相关（分别为r=0.309，P<0.001和r=0.248，P=0.001），与较低的FSH（r=-0.327，P<0.001）和LDL胆固醇（r=-0.171；P=0.018）相关。携带rs2247911的GG基因型的患者精子计数高于GA基因型（P=0.043），与AG和AA基因型相比，睾酮血清水平更高（P=0.004，P=0.001），甘油三酯水平较低（P=0.002，P<0.001）。在LH水平和体重指数标准化后，rs2274911和ucOCN在逐步线性回归分析中与较高的血清T显著相关（P=0.013，P=0.007）。这些数据表明，ucOCN-GPRC6A轴参与调节睾丸的T生产，辅助于HPG[2]。

为了测试人类多态性在体内的生理重要性，研究人员使用CRISPR/Cas9系统通过靶向基因组人源化小鼠，将GPRC6A小鼠基因中第三细胞内环（ICL3）中的RKLP序列替换为人类独有的KGKY序列，以创建Gprc6a-KGKY敲入小鼠。敲入人类KGKY序列导致基础血糖水平降低，循环血清胰岛素和FGF-21浓度增加。Gprc6a-KGKY敲入小鼠表现出改善的葡萄糖耐量，尽管胰岛素敏感性受损且丙酮酸介导的糖异生增强。Gprc6a-KGKY敲入小鼠的肝脏转录组分析确定了葡萄糖、糖原和脂肪代谢途径的变化。因此，人类独有的GPRC6A-KGKY变异似乎是一种功能获得性多态性，它积极调节小鼠的能量代谢[3]。

GPRC6A基因中rs2274911多态性与正常体重和肥胖受试者中的胰岛素抵抗相关。为了研究rs2274911多态性在葡萄糖和脂质代谢中的作用，研究人员回顾性地选择了392名男性和女性，包括218名肥胖患者和174名年龄匹配的正常体重对照。正常体重组和肥胖组中rs2274911等位基因和基因型的分布没有差异（所有P>0.05）。年龄和OC调整的多变量分析表明，在正常体重组中，与GG纯合子相比，GA（P=0.016和P=0.025）和AA基因型（P=0.033和P=0.040）的空腹胰岛素和HOMA-IR增加。在肥胖组中，AA纯合子的空腹血糖增加（P=0.041 vs GG）。甘油三酯、空腹胰岛素和HOMA-IR在GA（P=0.020，P<0.001和P=0.001）和AA基因型（P=0.021，P=0.013和P=0.013）中增加。在一组正常体重和肥胖受试者中，我们发现GPRC6A基因中非稀有单核苷酸多态性rs2274911与胰岛素抵抗特征相关，独立于代谢表型和OC水平[4]。

GPRC6A在前列腺癌的发生机制中发挥作用，但由于3号细胞内环（IL）中K.Y多态性造成的拟容忍基因变异，其作用仍不确定。研究人员通过测序3号IL区域的序列，确定了K.Y多态性是否存在于人类前列腺癌细胞系中，并通过免疫荧光评估了含有K.Y序列的“人化”小鼠GPRC6A的细胞定位。他们评估了GPRC6A在表达内源性GPRC6A的PC-3细胞和通过CRISPR/Cas9技术创建的GPRC6A缺陷PC-3细胞中的功能。在体外，在野生型和PC-3缺陷细胞系中评估了GPRC6A对基础和配体刺激的细胞增殖和迁移的影响。在体内，通过将野生型和PC-3缺陷细胞植入Xenograft小鼠模型并给予GPRC6A配体骨钙素进行治疗，评估了编辑GPRC6A对前列腺癌生长和进展的影响。研究人员发现，所有测试的人类前列腺癌细胞系都内源性表达3号IL中的“K.Y”多态性。将小鼠野生型GPRC6A与通过将“RKLP”替换为“K.Y”序列创建的“人化”小鼠GPRC6A结构进行比较，发现两种受体主要表达在细胞表面。然而，转染的“人化”GPRC6A受体与ERK信号相比，优先激活mTOR信号。相比之下，在表达内源性GPRC6A的PC-3细胞中，配体骨钙素刺激ERK、AKT和mTOR磷酸化，促进细胞增殖和迁移，并上调调节睾酮生物合成的基因。通过CRISPR/Cas9技术靶向PC-3细胞中的GPRC6A，在体外显著阻断了这些反应。此外，GPRC6A缺陷的PC-3异种移植瘤的生长明显减少，并且与表达GPRC6A的对照PC-3细胞相比，对骨钙素诱导的前列腺癌进展具有抵抗力。人类GPRC6A是一种功能性骨钙素和睾酮感应受体，促进前列腺癌的进展。GPRC6A可能有助于前列腺癌中的种族差异，并且是开发拮抗剂治疗前列腺癌的潜在治疗靶点[5]。

GPRC6A是一种营养感应GPCR，在体外被多种配体激活，包括氨基酸、钙、锌、骨钙素（OC）和睾酮。营养因素与前列腺癌风险之间的关系，前列腺癌细胞中OC表达增加的发现，以及GPRC6A与日本男性前列腺癌风险之间的关系，暗示了GPRC6A在前列腺癌中的作用。研究人员检查了GPRC6A是否在人类前列腺癌细胞系中表达，并使用siRNA介导的GPRC6A表达下调来探索GPRC6A在体外前列腺癌细胞中的作用。为了评估GPRC6A在前列腺癌进展中的作用，研究人员将Gprc6a(-/-)小鼠与TRAMP小鼠前列腺癌模型杂交。与正常前列腺RWPE-1细胞系相比，GPRC6A转录本在前列腺癌细胞系22Rv1、PC-3和LNCaP中显著增加。此外，包括钙、OC和精氨酸在内的一组GPRC6A配体在前列腺癌细胞系中表现出剂量依赖性刺激ERK活性、细胞增殖、趋化性和前列腺特异性抗原和Runx2基因表达。这些反应通过siRNA介导的GPRC6A下调被抑制。最后，将Gprc6a缺陷转移到TRAMP小鼠前列腺癌模型上，显著延迟了前列腺癌的进展，并改善了复合Gprc6a(-/-)/TRAMP小鼠的存活率。GPRC6A是调节前列腺生长和癌症进展的新分子靶点。GPRC6A的增加可能会增强前列腺癌细胞对饮食和骨衍生配体的增殖反应[6]。

GPRC6A是细胞膜中的氨基酸传感器。尽管有大量证据表明GPRC6A在代谢中的作用，但该基因对代谢过程的具体影响和作用机制仍未解决。在这项研究中，研究人员确定了GPRC6A野生型（WT）和敲除（KO）小鼠与肝脏和肾脏功能相关的血清生化参数和血清氨基酸水平。此外，还进行了非靶向血清代谢组学分析，据我们所知，这是首次进行此类分析，以揭示GPRC6A在代谢过程中的功能。GPRC6A参与脂质和氨基酸代谢，主要通过影响肝脏功能。GPRC6A功能的丧失可能会干扰胆汁酸代谢，从而导致不饱和脂肪酸代谢异常。GPRC6A KO可能在饥饿状态下导致过多的蛋白质分解，GPRC6A的丧失对苯丙氨酸代谢相关途径有显著影响。这些代谢组学数据为GPRC6A的进一步功能研究提供了新的基础[7]。

GPRC6A被公认为通过未羧化骨钙素（ucOCN）的作用，通过能量代谢和男性生育能力的主要调节因子，代表着一种可能的代谢和内分泌疾病的治疗靶点。研究人员最近表明，性激素结合球蛋白（SHBG）通过可能涉及141-161结构域的参与，与GPRC6A结合。为了确认这一模型，研究人员在这里研究了SHBG(141-161)结构域肽（SHBG141-161）对GPRC6A的可能的结合和激动剂活性。通过计算机模拟了SHBG141-161与GPRC6A的结合以及下游与Gαi(GDP)蛋白的解离。通过固相合成获得了SHBG141-161，并通过圆二色性（CD）对其进行了表征，并通过在转染GPRC6A基因的HEK-293细胞上置换ucOCN来评估受体结合。通过GPRC6A介导的睾酮（T）和胰岛素的释放，在Leydig MA-10和Langerhans β-TC6细胞系中评估了SHBG141-161的激动剂活性。预测SHBG141-161与GPRC6A结合，并降低对Gαi(GDP)的亲和力。通过CD和置换实验证实了合成SHBG141-161的构象特性和与GPRC6A的结合。SHBG141-161刺激细胞分泌T和胰岛素，T释放的剂量依赖性为10-13至10-11M（分别为P=0.041 10-13M；P=0.032 10-12M；P=0.008 10-11M vs基础），胰岛素的剂量依赖性为10-12至10-10M（分别为P=0.041 10-12M；P=0.007 10-11M；P=0.047 10-10M；P=0.045 vs基础）。用抗GPRC6A IgG阻断消除了对SHBG141-161的反应，表明激动剂特异性。SHBG141-161在GPRC6A上表现出刺激活性，代表着一种具有治疗代谢和内分泌疾病的可能用途的模板肽[8]。

G蛋白偶联受体C族第6成员A（GPRC6A）是前列腺癌（PCa）易感基因，并被证明可以调节PCa进展。然而，其在PCa转移中的作用尚不清楚。这项研究的目的是通过病例对照分析和体外分析，确认GPRC6A与侵袭性PCa之间的关联，并探讨GPRC6A在PCa转移中的作用。研究人员评估了916名受试者中14个与GPRC6A相关联的单核苷酸多态性（SNPs）与PCa风险和侵袭性PCa之间的关系。通过GPRC6A短发夹RNA（siRNA）在PC3细胞中下调GPRC6A表达，以确定转移行为。在GPRC6A过表达的PC3细胞中检测了骨转录因子runt相关转录因子2（RUNX2）和上皮-间质转化（EMT）标记基因的表达。在PCa患者和对照组中测试的14个SNPs中，有4个与侵袭性PCa相关（p=0.032-0.037，优势比=1.38-1.41）。GPRC6A短发夹RNA转染的PC3细胞的迁移和侵袭能力降低。GPRC6A下调细胞的MMP2和MMP9活性水平降低。此外，在GPRC6A过表达的细胞中，RUNX2、EMT和ERK信号上调。这些发现表明，GPRC6A与侵袭性PCa相关。GPRC6A下调抑制PCa细胞的迁移和侵袭，GPRC6A过表达促进EMT。这表明GPRC6A可能成为转移性PCa的潜在治疗靶点[9]。

GPRC6A是一种广泛表达的孤儿G蛋白偶联受体，在体外感应细胞外氨基酸、骨钙素和二价阳离子。GPRC6A的生理功能尚不清楚。在这项研究中，研究人员创建并表征了GPRC6A(-/-)小鼠的表型。GPRC6A(-/-)小鼠表现出涉及表达GPRC6A的多个器官系统的复杂代谢异常，包括骨、肾、睾丸和肝脏。GPRC6A(-/-)小鼠表现出肝脂肪变性、高血糖、葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。此外，研究人员观察到GPRC6A在睾丸间质细胞中高度表达。GPRC6A的缺失导致雄性GPRC6A(-/-)小鼠雌性化，与瘦体重减少、脂肪量增加、循环雌二醇水平升高和睾酮水平降低相关。GPRC6A也高度表达在肾近端和远端肾小管中，GPRC6A(-/-)小鼠表现出尿Ca/Cr和PO(4)/Cr比例增加以及低分子量蛋白尿。最后，GPRC6A(-/-)小鼠表现出骨矿物质密度（BMD）降低，与骨矿化受损相关。GPRC6A(-/-)小鼠具有代谢综合征的特征，包括缺陷的骨形成细胞介导的骨矿化、异常的肾脏对钙和磷的处理、脂肪肝、葡萄糖不耐受和紊乱的类固醇生成。这些发现表明，GPRC6A的整体功能可能是通过感应细胞外氨基酸、骨钙素和二价阳离子来协调多个组织的合成反应[10]。

综上所述，GPRC6A是一种广泛表达的G蛋白偶联受体，被提议是复杂内分泌网络和代谢过程的主调节因子。GPRC6A在多种代谢过程中发挥作用，包括胰岛素、葡萄糖和脂肪代谢。GPRC6A的功能丧失与代谢综合征相关，而GPRC6A的激活可以改善胰岛素敏感性并保护免受高脂肪饮食引起的代谢异常。GPRC6A还在骨、心血管、免疫和皮肤功能中发挥作用。GPRC6A在前列腺癌细胞中的表达增加，抑制GPRC6A可以减轻小鼠模型中PCa的进展。GPRC6A的基因多态性可能对发展MetS和PCa的种族差异有所贡献。如果GPRC6A在老鼠中确定的调节功能在人类中得以实现，并且GPRC6A的基因多态性被证明可以预测人类疾病中的种族差异，那么GPRC6A可能成为预测、预防和治疗MetS、PCa和其他受GPRC6A影响的疾病的新基因靶标。