Ptf1a-flox 基因敲除小鼠

Ptf1a，也称为胰腺转录因子1a，是一种关键的螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子。它在胰腺、视网膜、脊髓、大脑和肠神经系统中选择性表达[1]。Ptf1a在胰腺发育过程中起着不可或缺的作用，控制多能祖细胞的扩增，以及腺泡细胞的特化和维持。在神经组织中，Ptf1a在细胞分裂后期的细胞中短暂表达，并指定抑制性神经元的细胞命运，这主要是通过下游基因如Tfap2a/b和Prdm13介导的。编码和非编码调节序列中的突变导致Ptf1a获得或失去功能，与遗传疾病相关，如啮齿类动物和人类中的胰腺和 cerebellar agenesis [1]。

Ptf1a基因的剂量对胰腺的发育和功能至关重要。Ptf1a剂量减少导致胰腺发育不良和葡萄糖耐受不良，以及胰岛素分泌不足[2]。在低表达突变小鼠中，胰腺芽的大小较小，胰腺祖细胞中有很大一部分被错误指定为胆总管和十二指肠细胞。生长、分支形态发生和随后的外分泌细胞分化减少并延迟。β细胞总数减少，非β胰岛细胞的比例增加，α细胞异常地与β细胞混合。有趣的是，Pdx1表达在早期胰腺祖细胞中减少，但在胰腺发生的中间和后期阶段升高至正常水平[2]。

Ptf1a的功能和转录cis-调节是脊椎动物胰腺发育的基石。脊椎动物胰腺器官发生是一个逐步的过程，由复杂的信号和转录事件网络调节，逐步引导早期内胚层向胰腺命运发展。许多关键参与者在这个过程中已经被确定，包括信号通路、顺式调节元件和转录因子(TFs)。胰腺相关转录因子1a(PTF1A)就是这样一种TF，对胰腺发育至关重要。PTF1A突变导致与严重并发症相关的胰腺表型，如新生儿糖尿病和由于外分泌胰腺功能不足而导致的消化不良[3]。

miR-802在胰腺炎早期和胰腺癌发生过程中抑制腺泡到导管的再编程。胰腺导管腺癌(PDAC)是一种高度侵袭性的肿瘤，在人类中几乎总是致命的。超过90%的人类PDAC中发现了KRAS的激活突变，足以在肿瘤发生过程中促进腺泡到导管的转化(ADM)。miRNAs在致癌Kras诱导的ADM中的作用尚不清楚。在这项研究中，我们在Ptf1aCre/+LSL-KrasG12D/+和Ptf1aCre/+LSL-KrasG12D/+LSL-p53R172H/+和caerulein诱导的急性胰腺炎小鼠模型中研究了miR-802的功能。我们发现miR-802是一种在腺泡中高度丰富和富集的胰腺miRNA，在损伤或致癌KrasG12D诱导的转化的早期阶段被沉默。miR-802的基因缺失与KrasG12D协同促进ADM形成。miR-802缺失导致miR-802靶标Arhgef12、RhoA和Sdc4的去抑制，RhoA的激活，以及下游RhoA效应物ROCK1、LIMK1、COFILIN1和EZRIN的诱导，从而增加F-肌动蛋白的重排。miR-802缺失还激活SOX9，导致导管水平增加和腺泡身份基因的表达减弱。与这些发现一致，我们发现miR-802-RhoA-F-肌动蛋白网络在胰腺癌患者的活检中激活，与不良生存相关。我们发现miR-802通过抑制致癌Kras诱导的ADM抑制胰腺癌的启动。miR-802在ADM中的作用填补了我们对致癌Kras诱导的F-肌动蛋白重组、腺泡再编程和PDAC启动的理解空白。miR-802-RhoA-F-肌动蛋白网络的调节可能是干扰胰腺癌发生的一种新策略[4]。

Ptf1a是一个bHLH转录基因，它定义了小脑中的GABA能神经元命运。分子机制控制谷氨酸能-GABA能神经元亚型特异性尚不清楚。在这里，我们描述了一个小脑突变体，cerebelless，成年后缺乏整个小脑皮层。突变体大脑的主要缺陷是抑制小脑室区(VZ)的GABA能神经元产生，导致发育过程中外部颗粒层、脑桥和橄榄核的继发和完全丧失。我们确定了负责的基因Ptf1a，其在小脑VZ中的表达丧失，但在cerebelless的胰腺中保持。谱系追踪显示，在小脑VZ中存在两种神经祖细胞：Ptf1a表达和非表达的祖细胞，分别产生GABA能和谷氨酸能神经元。将Ptf1a引入背侧端脑中的谷氨酸能神经元祖细胞中，产生了具有代表性的形态和迁移特征的GABA能神经元。我们的结果表明，Ptf1a参与驱动神经祖细胞在小脑中分化为GABA能神经元[5]。

Ptf1a启动子驱动的Cre表达在精子发生期间导致生殖细胞重组。两个独立开发的Ptf1a-Cre小鼠系，Ptf1atm1(cre)Hnak和Ptf1atm1(Cre)Cvw，广泛应用于胰腺研究中。最近，Ptf1atm1(cre)Hnak系被报道存在不必要的父系重组。我们的目的是研究Ptf1atm1(Cre)Cvw系中是否存在这种现象。Ptf1atm1(Cre)Cvw小鼠与R26-LSL-LacZ报告基因小鼠杂交。通过重组特异性聚合酶链反应、逆转录-聚合酶链反应和X-Gal染色检查DNA重组和基因表达。在双转基因小鼠的胰腺、睾丸和精子中检测到R26位点的重组。来自睾丸的ptf1a mRNA表达呈阳性，表明该组织中有内源性Ptf1a启动子活性。在从雄性双转基因小鼠中继承LacZ的15个后代中，有4个(26.7%)呈完全全身重组阳性。R26小鼠中重组的存在表明重组发生在减数分裂之前。Ptf1a启动子驱动的Cre表达在减数分裂之前的精子发生期间是生殖细胞重组的原因。因此，当使用雄性Ptf1a-Cre小鼠进行复合小鼠繁殖时，除了需要检测打靶等位基因外，还需要检测重组等位基因，以检查不必要的重组[6]。

在433,540名东亚个体中确定了2型糖尿病的位点。全基因组关联研究(GWAS)的荟萃分析已经确定了240多个与2型糖尿病(T2D)相关的位点；然而，大多数这些位点是在分析欧洲血统的个体中确定的。在这里，为了检查东亚个体中T2D的风险，我们对77,418名T2D患者和356,122名健康对照个体的GWAS数据进行了荟萃分析。在主要分析中，我们在183个位点确定了301个不同的关联信号，并且在与和没有考虑体重指数和性别的T2D关联模型中，我们确定了61个位点与T2D的易感性有关。在东亚和欧洲人群中，与T2D相关的常见变异表现出强烈的相关效应大小。先前未描述的关联包括GDAP1、PTF1A、SIX3、ALDH2、微RNA簇和影响肌肉和脂肪细胞分化的基因中的信号[7]。

在胰腺导管腺癌细胞中诱导PTF1a表达激活腺泡基因网络，减少肿瘤特性，并对吉西他滨治疗敏感。胰腺腺泡细胞合成、包装并向十二指肠分泌消化酶，以帮助营养吸收并满足代谢需求。当暴露于细胞应激和损伤时，腺泡细胞会经历一种称为腺泡-导管转化(ADM)的去分化过程。具有致癌突变的ADM病变最终会导致胰腺导管腺癌(PDAC)。在健康的胰腺中，基本螺旋-环-螺旋(bHLH)因子MIST1和PTF1a协调一个腺泡特异性转录网络，维持细胞高度发达的分化状态，保护胰腺免受转化过程的影响。然而，当MIST1和PTF1a基因表达被沉默时，细胞更容易进展为PDAC。在这项研究中，我们测试了在PDAC细胞中诱导MIST1或PTF1a表达是否能够(i)重新建立分化腺泡细胞的转录程序，(ii)同时减少肿瘤细胞特性。如预期的那样，PTF1a诱导消化酶和腺泡特异性转录因子的基因表达，而MIST1诱导囊泡转运分子的基因表达，以及未折叠蛋白反应成分的激活，这些都是处理腺泡细胞特征性高蛋白产生负荷所必需的。重要的是，在PDAC中诱导PTF1a还影响了与癌症相关的特性，导致细胞增殖减少，癌症干细胞数量减少，以及抑制关键ATP结合盒外排转运蛋白的表达，导致对吉西他滨的敏感性增强。因此，激活胰腺bHLH转录因子挽救了腺泡基因程序，并减少了胰腺癌细胞中的肿瘤特性，为开发针对这种致命疾病的新疗法干预策略提供了独特的机会[8]。

在斑马鱼胰腺发生和再生过程中对Ptf1a表达细胞的命运图谱进行绘制。斑马鱼胰腺发育与哺乳动物共享许多特征，包括参与胰腺转录因子1a(ptf1a)表达的表皮祖细胞的参与。然而，到目前为止，尚不清楚是否像哺乳动物一样，ptf1a表达的斑马鱼胰腺祖细胞能够为多个外分泌和内分泌谱系做出贡献。为了确定ptf1a表达细胞的谱系潜能，我们生成了ptf1a:creER(T2)转基因鱼，并在发育、再生和ptf1a缺陷的斑马鱼胰腺中进行了遗传诱导谱系追踪。除了对腺泡细胞谱系的贡献外，ptf1a表达细胞在胰腺发育过程中还产生胰腺Notch反应细胞(PNCs)和小部分内分泌细胞。在ptf1a半合子不足的鱼中，更大比例的ptf1a谱系标记细胞被追踪到PNC和内分泌部分。进一步降低ptf1a基因剂量将胰腺祖细胞转化为胆囊和其他非胰腺细胞命运。我们的结果表明，在发育中的斑马鱼胰腺中存在多能的ptf1a表达祖细胞，ptf1a剂量减少促进了对非腺泡谱系的更大贡献。与哺乳动物一样，Ptf1a的丧失导致新生胰腺祖细胞转化为非胰腺细胞命运，突出了Ptf1a在前肠组织谱系决定中的核心作用[9]。

综上所述，Ptf1a是一种重要的转录因子，在胰腺发育、神经组织分化和多种生物学过程中发挥着重要作用。Ptf1a的突变与多种遗传疾病相关，包括新生儿糖尿病和胰腺和 cerebellar agenesis。Ptf1a基因剂量的变化会影响胰腺的发育和功能，导致胰腺发育不良和糖尿病。Ptf1a在癌症发生和发展中也发挥着重要作用，通过调节基因表达和细胞特性影响肿瘤的形成和进展。Ptf1a的研究有助于深入理解胰腺发育、神经分化和癌症发生机制，为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。