Lhx9-flox 基因敲除小鼠

Lhx9，也称为LIM Homeobox 9，是一种属于LIM-homeodomain基因家族的转录因子。LIM-homeodomain基因家族是一类编码含有LIM结构域和homeodomain结构域的蛋白质的基因，这些蛋白质在多种生物学过程中发挥着重要作用，包括器官形成、细胞分化和信号传导等。Lhx9在哺乳动物胚胎发生过程中，尤其在脑、生殖腺、肢体和心脏等器官的发育中发挥着关键作用。

Lhx9在早期肢体发育中起着重要作用。在肢体发育过程中，Lhx9被证明是整合纤维母细胞生长因子（FGF）和音猬因子（Shh）信号通路的整合器，这些信号通路对于肢体的近端-远端（PD）和前-后（AP）轴的形成至关重要。在发育过程中，Lhx9有三种剪接变体，其中两种被预测为显性负性作用，它们通过LIM结构域与Lhx9的DNA结合变体竞争结合辅因子[1]。

Lhx9在松果体发育中也起着关键作用。在哺乳动物胚胎发生过程中，Lhx9在包括松果体在内的脑组织中表达。Lhx9的缺失会导致不育，这是由于生殖腺发育失败。研究发现，Lhx9在松果体中的表达水平在发育早期达到峰值，随后在成年期降至几乎检测不到的水平。在Lhx9缺失的小鼠中，浅层松果体发育不良，深层松果体和松果体柄的体积也减小。此外，Lhx9的缺失还会导致约70%的小鼠在5-8周龄时发生严重的脑积水，这是首次发现Lhx9的缺失会导致脑积水，表明Lhx9对维持正常的脑结构至关重要[2]。

Lhx9在发育的前脑中也有表达。Lhx9在胚胎发生过程中的时空表达模式与Lhx2相似但有所不同。Lhx9在发育过程中的最高表达水平出现在间脑、端脑泡和背侧中脑。Lhx9的表达区域尊重了提出的神经元边界。此外，Lhx9也在脊髓、前肢和后肢间充质以及泌尿生殖系统中表达。Lhx9的表达模式及其结构特征表明，它编码的转录因子可能参与控制多种神经细胞类型的细胞分化。此外，Lhx9蛋白可以与其他在重叠模式中表达的LIM-homeodomain因子以组合方式发挥作用[3]。

Lhx9在发育的脑皮层中的先驱神经元中表达。Lhx9和Lhx2在发育的脑皮层中具有重叠的表达模式，但在其他发育区域则有所不同。因此，在这些发育区域中，这两种高度相关的蛋白质可能具有功能冗余性。Lhx9在发育的肢体中与Lhx2具有相似的表达模式。根据Lhx9的表达模式及其发育调节，研究者们提出Lhx9可能参与控制脑皮层先驱神经元的规范或功能。研究还发现，Lhx9和Lhx2都与LIM结构域结合蛋白Ldb1/Nli1/Clim2结合[4]。

Lhx9在胶质瘤中表达下调，并通过抑制糖酵解来抑制胶质瘤的进展。研究发现在胶质瘤组织中，Lhx9的表达水平下降。上调Lhx9的表达可以抑制胶质瘤细胞在液体培养基和软琼脂糖上的生长。分子机制研究发现，Lhx9与p53相互作用，下调Lhx9的表达促进了与糖酵解相关的酶PGK1的表达并增加了乳酸含量。通过干扰Lhx9的表达，可以促进胶质瘤细胞的致瘤性，而进一步干扰PGK1的表达可以阻止这种致瘤性的发生。这表明，Lhx9在胶质瘤中通过调节糖酵解相关酶PGK1的表达来抑制胶质瘤的进展[5]。

Lhx9衍生的兴奋性中间神经元调节小鼠的行走频率。研究者们使用RNA测序从新生小鼠的兴奋性、非兴奋性和Shox2细胞中鉴定出转录因子，这些转录因子在兴奋性脊髓神经元中高度表达，并且在Shox2神经元和兴奋性神经元之间存在差异表达。通过这些分析，研究者们鉴定出Lhx9衍生的神经元，它们在脊髓中具有受限的表达模式，并且与Shox2神经元没有重叠。这些神经元是纯兴奋性的，并且是同侧投射的。通过消除兴奋性传导或急性灭活Lhx9衍生的神经元的神经活动，可以导致行走样活动的频率降低，而不会改变协调模式。通过光遗传学激活Lhx9衍生的神经元可以促进行走样活动并调节行走活动的频率。Lhx9衍生的神经元的钙活动在行走样活动期间显示出强烈的左右相位不一致的节律性。这项研究确定了一种独特的脊髓兴奋性神经元群体，它们调节行走输出的频率，并可能在小鼠中与其他脊髓群体一起参与节律生成[6]。

Lhx9作为性反转候选基因的排除。研究者们排除了Lhx9作为Sry阴性XX性反转候选基因的可能性。在美洲可卡犬中，XX性反转是一种常染色体隐性性状，受影响的动物缺乏睾丸决定因子Sry基因。研究者们使用一个Lhx9内含子微卫星标记对一个具有Sry阴性XX性反转表型的美洲可卡犬系谱进行了基因分型。Lhx9标记在系谱中的分离表明，犬Lhx9的突变不太可能是Sry阴性XX性反转的原因。此外，研究者们还报道了犬Lhx9的定位和基因组组织结构[7]。

Lhx9是小鼠生殖腺形成的必要基因。在哺乳动物胚胎发育过程中，卵巢和睾丸从泌尿生殖嵴的体细胞中发育而来，这些体细胞中包含有迁移到那里的原始生殖细胞。在生殖腺的性别决定后，睾丸产生睾酮和抗苗勒管激素，介导男性性别的分化，而女性发育途径在没有这些激素的情况下继续进行。研究发现，Lhx9的mRNA在小鼠胚胎第9.5天的泌尿生殖嵴中存在；在形态学分化发生时，它们定位于间质区。在Lhx9功能缺失的小鼠中，生殖细胞迁移正常，但生殖嵴的体细胞未能增殖，未能形成明显的生殖腺。在没有睾酮和抗苗勒管激素的情况下，遗传学上的雄性小鼠表现出雌性表型。Lhx9缺失的生殖嵴中，类固醇生成因子1（Sf1）的表达降低到最低水平，Sf1是一种对生殖腺形成至关重要的核受体，这表明Lhx9可能位于Sf1上游的一个发育级联反应中。与缺乏其他介导生殖腺早期发育的基因的小鼠不同，Lhx9突变体没有表现出其他主要发育缺陷。因此，LHX9的突变可能与人某些形式的孤立性生殖腺发育不全有关[8]。

GATA4/FOG2转录复合物调节小鼠心脏发育中的Lhx9基因表达。GATA4和FOG2蛋白对于小鼠的正常心脏发育是必需的。研究者们发现，Lhx9基因是GATA4/FOG2复合物的直接靶点。研究显示，小鼠发育中的心脏通常表达Lhx9的截短变体-Lhx9alpha和Lhx9beta，而不是编码具有完整homeodomain的蛋白质的Lhx9-HD变体。在E9.5时，Lhx9alpha/beta的表达主要出现在心外膜原基和横隔中，而Lhx9-HD则不存在于这些组织中；在E11.5时，LHX9alpha/beta阳性的细胞局限于心外膜间皮。此后，在对照心脏中，Lhx9alpha/beta的心外膜表达迅速下调；相反，Fog2基因缺失的小鼠心脏未能抑制Lhx9alpha/beta的表达。来自E11.5心脏的染色质免疫沉淀显示，Lhx9是GATA4和FOG2的直接靶点。在瞬时转染研究中，Lhx9的顺式调控区域的表达由FOG2在完整的GATA4存在下抑制，而在GATA4ki突变体中，由于GATA4ki突变体在结合FOG2的能力受损，这种抑制并未发生。总的来说，Lhx9基因是GATA4/FOG2抑制复合物在心脏发育中的第一个直接靶点[9]。

LHX9（LIM Homeobox 9）转录因子增强丙酮酸激酶PKM2活性，诱导癌细胞干细胞的糖酵解代谢重编程，促进胃癌进展。糖酵解代谢重编程是细胞在恶性转化过程中发生的一种现象，主要涉及糖酵解、电子传递链、氧化磷酸化和磷酸戊糖途径的各个方面。这种重编程现象可以用作肿瘤发生和发展的标志之一。丙酮酸激酶是糖代谢过程中第三个限速酶，通过特异性催化PEP不可逆地转化为丙酮酸。这项研究旨在揭示调节胃癌中糖酵解代谢重编程的关键介质（s）及其潜在的分子机制，并探讨LHX9可能参与调节胃癌（GC）进展的分子机制。研究者们首先从TCGA和MSigDB数据库下载了GC和糖酵解相关的微阵列数据集，并取交集以筛选出调节GC糖酵解代谢重编程的转录因子LHX9。使用软件包进行差异分析、单基因预测分析和韦恩图。此外，还进行了糖酵解途径的富集分析。研究者们在90例GC患者中进行免疫组织化学染色，以检测LHX9和PKM2蛋白的表达，并通过Spearman相关系数方法评估它们之间的相关性。研究者们选择了三种人GC细胞系（AGS、NCI-N87、HGC-27）进行体外实验验证。使用流式细胞术确定GCSCs中干细胞标记CD44的表达状态。进行球形成试验以评估GCSCs的球形成能力。此外，研究者们还使用RT-qPCR和Western blot实验研究了GCSCs中肿瘤干细胞标记OCT4和SOX2的表达水平。研究者们还构建了慢病毒表达载体，以评估下调LHX9或PKM2对GCSCs糖酵解代谢重编程的影响。通过CCK-8、EdU和Transwell实验检测GCSCs的增殖、迁移和侵袭。随后，使用染色质免疫沉淀和双荧光素酶报告基因验证了LHX9和PKM2的相互作用。在裸鼠中建立皮下移植肿瘤模型，观察裸鼠体内肿瘤的大小和体积，并获得新鲜组织进行后续实验。生物信息学分析显示，LHX9可能通过调节糖酵解代谢参与胃癌的发生和发展。高LHX9表达可以作为预测GC患者预后的参考标志。临床组织检测发现，LHX9和PKM2在GC组织中高度表达。同时，GC组织也高度表达糖酵解相关蛋白GLUT1和肿瘤细胞干细胞标记CD44。体外细胞实验显示，LHX9可以通过直接与PKM2结合来增强其活性并诱导GCSCs中的糖酵解代谢重编程。此外，下调LHX9抑制了PKM2活性和糖酵解代谢重编程，并抑制了GCSCs的增殖、迁移和侵袭能力。体内动物实验进一步证实，下调LHX9可以通过抑制PKM2活性和糖酵解代谢重编程来降低GCSCs在裸鼠中的致瘤能力。这些发现表明，LHX9和PKM2在GC中高度表达，LHX9可能通过转录激活PKM2来诱导糖酵解代谢重编程，增强GCSCs的恶性生物学特性，最终促进胃癌进展[10]。

综上所述，Lhx9是一种重要的转录因子，参与调节多种生物学过程，包括器官形成、细胞分化和信号传导等。Lhx9在肢体发育、松果体发育、心脏发育和脑皮层发育中发挥着关键作用。Lhx9的缺失会导致生殖腺发育不全、松果体发育不良和脑积水等发育缺陷。此外，Lhx9还在胃癌中发挥重要作用，其表达下调会导致胃癌的发生和发展。Lhx9的研究有助于深入理解LIM-homeodomain基因家族在发育和疾病发生中的作用机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。