Nmb-KO 基因敲除小鼠

Nmb基因编码的蛋白被称为神经调节素B（Neuromedin B，NMB），属于哺乳动物中的一种bombesin（BN）相关肽。NMB最初是从猪脊髓中纯化出来的，存在于中枢神经系统以及胃肠道中。BN及其相关肽具有多种生理作用，包括调节外分泌和内分泌分泌、平滑肌收缩、摄食、血压、血糖、体温和细胞生长。NMB通过与细胞表面受体结合来发挥其作用，其中高亲和力受体NMB受体（NMB-R）已经被鉴定出来。NMB-R是一种G蛋白偶联受体，具有七个跨膜区域。当激动剂结合时，会触发多种细胞内信号级联反应，包括磷脂酶激活、钙动员和蛋白激酶C（PKC）激活，导致多种基因的表达、DNA合成或细胞分泌等效应。NMB-R的存在已经在多个脑区得到证实，特别是在嗅觉和丘脑区域，以及胃肠道中。使用NMB-R基因敲除小鼠进行的分析，有助于区分NMB-R的功能特性与GRP-R系统。与GRP/GRP-R系统的比较，提供了关于哺乳动物中BN样肽系统的重要信息[2]。

在肿瘤发生发展中，Nmb基因编码的GPNMB（Glycoprotein Nonmetastatic B）蛋白在巨噬细胞中显著上调。研究表明，巨噬细胞来源的可溶性GPNMB能够增加肿瘤的生长和转移。GPNMB在肿瘤细胞中触发自我更新的球体形成，这些球体特征是表达癌症干细胞标记物、细胞存活延长和肿瘤形成能力增强。通过CD44受体，GPNMB机制性地激活肿瘤细胞表达细胞因子IL-33及其受体IL-1R1L。研究还确定了重组IL-33与IL-1R1L的结合足以诱导具有癌症干细胞特征的肿瘤球体形成。这些结果表明，GPNMB和IL-33构成了一个新的旁分泌轴，在巨噬细胞与肿瘤细胞的相互作用中被激活，最终促进癌细胞存活、癌症干细胞的扩张和转移表型的获得[1]。

在前列腺癌中，GPNMB基因的表达与肿瘤的侵袭性和肿瘤形成能力相关。研究表明，GPNMB的表达可能受到雄激素的负调节。在体外和体内实验中，GPNMB的过表达显著降低了前列腺癌细胞的增殖和侵袭能力，并表现出抗肿瘤活性。GPNMB过表达诱导了PC-3细胞中N-myc下游调节基因1（Ndrg1）和maspin的表达。多柔比星处理或p53的瞬时过表达增加了GPNMB的表达。雄激素（R1881）处理对前列腺特异性抗原（PSA）和GPNMB的表达产生了不同的影响。这些结果提示GPNMB基因是一个受p53和雄激素调节的基因，应该被视为前列腺癌的抗肿瘤基因。Ndrg1和maspin基因表达的增加可能解释了GPNMB在PC-3细胞中的抗增殖和抗侵袭功能[3]。

在黑色素瘤中，nmb基因在低转移性人黑色素瘤细胞系和异种移植中表达。从减法cDNA文库中分离出几个cDNA克隆，它们在高度和低度转移性人黑色素瘤细胞系之间表现出不同的表达。其中一个克隆被命名为nmb，在低转移性细胞系中优先表达，并被选为进一步的特征化。序列分析表明，这个克隆代表了一个新基因，编码一个假定的跨膜糖蛋白，与pMEL17的前体具有最高的同源性，pMEL17是一种黑色素细胞特异性蛋白。nmb RNA表达在大多数测试的肿瘤细胞系中缺失，并不局限于黑色素细胞谱系。将部分nmb cDNA转染到高度转移性黑色素瘤细胞系（BLM）中，导致3个转染子中的2个皮下肿瘤生长减慢，1个转染子中自发性转移的潜力降低[4]。

在帕金森病（PD）中，LRRK2基因的突变是常染色体显性PD的主要原因，其中最常见的致病变异是LRRK2 p.G2019S。LRRK2蛋白在人类大脑和周围组织中高度表达，高表达PD基因的免疫细胞表明小胶质细胞和巨噬细胞在PD相关炎症中发挥作用。LRRK2已知对包括TLR4在内的细胞外信号作出反应，导致基因表达的改变，而对TLR2信号通过zymosan的反应知之甚少。研究发现，zymosan（TLR2激动剂）和强效特异性LRRK2激酶抑制剂MLi-2对LRRK2-WT和LRRK2 p.G2019S基因敲入小鼠的小胶质细胞的基因表达产生了影响。在LRRK2 p.G2019S小胶质细胞中，观察到铁转运和氧化应激反应的生物学过程富集。这些结果表明，小胶质细胞LRRK2可能通过改变炎症途径在PD发病机制中发挥作用[5]。

在脊髓缺血再灌注损伤（SCII）中，Nmb蛋白在神经炎症的传递中起着关键作用。SCII模型通过夹闭雄性SD大鼠的腹主动脉60分钟建立。通过Western blotting检测Nmb、Cav3.2和IL-1β的蛋白表达水平，而miR-214-3p的表达通过qRT-PCR进行量化。使用双荧光素酶报告基因检测miR-214-3p和Nmb之间的靶向调节。通过免疫荧光染色观察Nmb和Cav3.2在细胞特异性标记物中的细胞定位。通过鞘内注射Cav3.2-siRNA、PD168368（一种特异性的NmbR抑制剂）和合成的miR-214-3p激动剂和拮抗剂，分别探索miR-214-3p在SCII受损大鼠中Nmb/Cav3.2相互作用中的特异性作用。此外，通过改良的Tarlov评分评估后肢运动功能。与假手术组相比，SCII后24小时，Nmb、Cav3.2和促炎因子IL-1β的蛋白表达水平显著升高。与SCII组相比，鞘内注射PD168368和Cav3.2-siRNA显著抑制了Cav3.2和IL-1β的表达。miRDB数据库和双荧光素酶报告基因检测确定了Nmb是miR-214-3p的直接靶点。如预期，通过agomir-214-3p预处理在体内过表达miR-214-3p，显著抑制了SCII损伤大鼠中Nmb、Cav3.2和IL-1β表达的增加，并改善了后肢运动功能，而antagomiR-214-3p预处理逆转了这些效应。SCII大鼠中Nmb蛋白水平与Cav3.2表达呈正相关。上调miR-214-3p通过抑制Nmb/Cav3.2的异常相互作用和下游IL-1β的释放，改善了后肢运动功能并保护了神经炎症。这些发现为SCII的预防和治疗提供了新的治疗靶点[6]。

在肝脏纤维化中，巨噬细胞在炎症中通常被认为具有促纤维化作用。研究使用了一种易于操作的CCl4诱导的可逆性肝纤维化模型，以识别和表征负责组织重塑的巨噬细胞表型：迄今为止难以捉摸的修复性巨噬细胞。这种CD11B(hi) F4/80(int) Ly-6C(lo)巨噬细胞亚群在最大纤维化消退期间在肝脏中最为丰富，代表主要的基质金属蛋白酶（MMP）表达亚群。通过CD11B启动子-破伤风毒素受体（CD11B-DTR）转基因小鼠中清除这种群体导致瘢痕重塑失败。采用转移和原位标记实验表明，这些修复性巨噬细胞来自募集的Ly-6C(hi)单核细胞，这与促纤维化Ly-6C(hi)巨噬细胞的共同起源一致，表明在体内发生表型转变，赋予其促消退特性。与Ly-6C(hi)巨噬细胞相比，Ly-6C(lo)亚群的全基因组表达谱分析显示了一种超出M1/M2分类的表型，Mmp9、Mmp12、胰岛素样生长因子1（Igf1）和GPNMB的表达增加。共聚焦显微镜证实了修复性巨噬细胞的吞噬后性质。此外，通过给予脂质体诱导的吞噬行为在体内增加了修复性巨噬细胞的数量，并加速了纤维化消退，为这一孤儿病理过程提供了一种治疗方法[7]。

在神经系统中，NMB受体（NMB-R）缺陷的小鼠表现出减少的埋石行为，这表明NMB/NMB-R可能参与5-HT神经元功能。由于5-HT神经元被认为调节埋石行为，因此评估了NMB-R在行为中的作用。与野生型小鼠相比，NMB-R缺陷小鼠表现出减少的埋石行为。然而，用p-氯苯丙氨酸（p-CPA）处理以耗尽5-HT后，NMB-R缺陷小鼠的埋石行为增加，这表明NMB-R缺陷小鼠大脑中5-HT水平的升高导致埋石行为的减少。尽管高效液相色谱分析显示NMB-R缺陷和野生型小鼠全脑中的5-HT含量没有差异，但脑切片的免疫组织化学分析显示NMB-R缺陷小鼠中背缝核（DR）的5-HT表达升高。此外，定量RT-PCR分析显示NMB-R缺陷小鼠全脑水平的5-HT1A受体基因表达下调。这些行为和生物学结果提示NMB/NMB-R可能通过影响DR功能来调节5-HT神经元活性[8]。

在癌症中，GPNMB是一种跨膜糖蛋白，在多种癌症中过表达。它能够促进原发肿瘤的生长和转移，GPNMB的表达与患者的不良预后和较短的复发无病生存期相关。有越来越多的证据支持GPNMB在癌症环境中发挥免疫抑制作用的观点。这一综述描述了GPNMB作为免疫抑制诱导剂的日益增长的作用，特别关注其在通过抑制促炎的先天性和适应性免疫反应来介导癌症进展方面的作用[9]。

综上所述，Nmb基因编码的NMB蛋白在多种生物学过程中发挥重要作用，包括肿瘤生长、转移、炎症反应、神经系统和肝脏纤维化。NMB蛋白通过与其受体NMB-R结合，触发多种细胞内信号级联反应，影响基因表达和细胞功能。此外，Nmb基因的表达受到多种因素的调节，包括雄激素和TLR2信号。研究Nmb基因及其蛋白的表达和功能，有助于深入理解其在多种疾病中的作用机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。