Lef1-flox 基因敲除小鼠

Lef1，即淋巴样增强子结合因子1，是一种在Wnt信号通路中发挥关键作用的转录因子。Wnt信号通路是细胞内重要的信号传导途径之一，参与调控细胞分化和组织发育等生物学过程。Lef1能够与DNA上的特定序列结合，调控下游基因的表达，从而影响细胞的生物学行为。

在急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中，Lef1的精确作用一直存在争议。一方面，过表达的Lef1被报道与T-ALL的发生和发展有关；另一方面，一些研究也发现Lef1的失活突变与T-ALL的发生有关。为了进一步了解Lef1在T-ALL中的作用，研究者们通过siRNA技术敲低了Jurkat细胞中的Lef1，并使用微阵列分析比较了Lef1敲低细胞与非靶向siRNA转染和未转染细胞之间的基因表达水平。研究发现，DHRS2基因在Lef1敲低细胞中表达显著下调，并且通过qRT-PCR和Western blotting证实了其在mRNA和蛋白质水平的下调。这表明Lef1在Jurkat细胞中正向调控DHRS2基因的表达，提示Lef1具有肿瘤抑制因子的功能。结合之前的研究报道，Lef1在T-ALL中不仅通过其致癌靶基因发挥作用，还通过肿瘤抑制基因发挥调控作用[1]。

在胶质母细胞瘤中，Lef1也被发现具有重要的作用。Zeb1是上皮-间质转化（EMT）诱导因子，与胶质母细胞瘤的发生、侵袭和耐药性有关。研究发现，Zeb1在胶质母细胞瘤干细胞样细胞中的全基因组结合与基因表达的激活和抑制相关。Zeb1直接与DNA结合进行转录抑制，而通过Wnt信号通路效应因子Lef1的间接招募到调节区域导致基因激活，独立于Wnt信号传导。在Zeb1激活的胶质母细胞瘤基因中，包括Prex1等预测的肿瘤细胞迁移和侵袭的调节因子，Prex1的高表达预示着胶质母细胞瘤患者生存期缩短[2]。

此外，Lef1在下丘脑神经发生中也发挥重要作用。研究发现，Wnt/β-catenin效应因子Lef1对于斑马鱼和小鼠中抗焦虑性下丘脑神经元的分化是必需的，尽管这两种物种中Lef1依赖性基因和神经元的身份不同。进一步的研究发现，斑马鱼和果蝇在各自的神经内分泌器官中具有共同的Lef1依赖性基因表达，这与一个保守的通路在小鼠中发生了分化相一致。最后，斑马鱼和鼠Lef1依赖性基因的同源物在小狨和人类中表现出高度相关性的下丘脑表达，这表明灵长类动物中存在两个并行调节焦虑的通路。这些发现表明，在进化过程中，一个转录因子可以通过多种机制产生共同的行为输出，并且Lef1调节的回路发展对于广泛动物种类的焦虑调节至关重要[3]。

除了上述作用，Lef1的表达还受到非编码反义转录本的调控。研究发现，一个自然反义转录本（NAT）从LEF1基因的第一个内含子中的启动子转录，并在间充质细胞中进行剪接。尽管这个位点在上皮细胞中是沉默的，并且NAT转录本和LEF1 mRNA都没有表达，但在具有低LEF1表达的中间上皮-间质表型的细胞系中，NAT被合成并且保持未加工状态。与剪接后的NAT不同，未剪接的NAT下调了LEF1主要启动子的活性，并减弱了LEF1 mRNA的转录。未剪接的LEF1 NAT与LEF1启动子相互作用，促进PRC2结合到LEF1启动子上，并促进组蛋白3上赖氨酸27的三甲基化。转染剪接形式的LEF1 NAT可以防止未剪接NAT的作用，通过与启动子竞争相互作用。因此，这些结果表明LEF1基因表达受到反义非编码RNA的抑制，并且这种NAT功能受到其剪接和未剪接形式之间平衡的调控[4]。

除了上述作用，LEF1还与皮肤色素沉着有关。研究发现，在非洲人中，皮肤颜色高度变异，但对其背后的分子机制知之甚少。研究者们应用大规模平行报告基因分析筛选了1157个影响非洲人皮肤色素沉着的候选变异，并确定了165个显示等位基因间差异调节活性的单核苷酸多态性。通过结合Hi-C、基因组编辑和黑色素测定，研究者们确定了影响黑色素水平的MFSD12、HMG20B、OCA2、MITF、LEF1、TRPS1、BLOC1S6和CYB561A3的调节元件，这些元件调节人类皮肤颜色。研究发现，OCA2增强子中的独立突变有助于人类皮肤颜色多样性的进化，并在MITF、LEF1和TRPS1的增强子中检测到局部适应的信号，这可能有助于来自南非的科伊桑语人群的浅色皮肤。此外，研究者们还发现CYB561A3是一个新的色素沉着调节因子，影响参与氧化磷酸化和黑色素生成的基因。这些结果为了解人类皮肤颜色多样性和适应性进化的机制提供了见解[5]。

在肝细胞癌（HCC）中，LEF1也被发现具有重要的作用。研究发现，持续使用乐伐替尼治疗增强了上皮-间质转化（EMT）、细胞迁移和细胞侵袭。对Hep3B-LR和相应亲代细胞RNA测序的基因集富集分析（GSEA）富集分析表明，Wnt信号通路的激活参与了这一适应性过程。活跃的β-catenin及其下游靶点淋巴样增强子结合因子1（LEF1）在LR HCC细胞中显著升高，通过介导EMT相关基因促进了乐伐替尼耐药性。基于基因表达综合数据库（GEO）和癌症基因组图谱计划（TCGA）数据库的数据分析表明，LEF1作为EMT的关键调节因子，是与乐伐替尼耐药性和HCC不良预后相关的新型分子靶点。使用小分子特异性抑制剂ICG001和敲低LEF1表明，靶向LEF1恢复了LR HCC细胞对乐伐替尼的敏感性。这些结果揭示了LEF1上调通过促进LR HCC细胞的EMT、细胞迁移和侵袭而赋予乐伐替尼耐药性，表明LEF1是克服获得性乐伐替尼耐药性的新型治疗靶点[6]。

除了上述作用，LEF1还与转录因子TFAP4有关。研究发现，激活增强子结合蛋白4（TFAP4）的转录因子在多种癌症中过表达，与侵袭性表型相关。然而，TFAP4致癌作用的精确机制仍然 largely 未知。研究发现，TFAP4在人类HCC中显著上调，并且与HCC患者的总生存期和复发无病生存期显著较差相关。进一步的研究发现，TFAP4的过表达显著增强了HCC细胞的肿瘤球形成能力和侧群细胞比例，而敲低TFAP4则抑制了这些能力。机制上，研究结果表明TFAP4在激活Wnt/β-catenin信号传导中发挥重要作用，通过直接结合到DVL1（分散的极性蛋白1）和LEF1（淋巴样增强子结合因子1）的启动子上。这些结果为了解HCC中Wnt/β-catenin通路过度激活的机制以及TFAP4增强HCC细胞成瘤能力的作用提供了新的见解[7]。

此外，LEF1还与软骨矿化有关。研究发现，软骨矿化是一个受严格控制的过程，对于骨骼生长和骨折修复至关重要。然而，在骨关节炎（OA）中，软骨矿化可能影响关节活动范围，引起疼痛，并增加关节积液的机会。研究者们通过靶向Sirtuin 1（SIRT1）和淋巴样增强子结合因子1（LEF1）来理解炎症和软骨矿化之间的联系，这两个因子据报道对软骨具有相反的影响。研究发现，SIRT1的炎症依赖性裂解或其软骨特异性基因敲除直接增强了LEF1的表达，并伴随着分解代谢反应。应用创伤后OA（PTOA）模型到软骨特异性Sirt1敲除体上显示出严重的OA，伴随着滑膜炎、半月板矿化和外侧关节腔的骨赘形成。相比之下，软骨特异性Lef1敲除体表现出减少的外侧矿化、OA严重程度和局部疼痛。差异基因表达分析表明，Lef1敲除降低了核因子κB（NF-κB）和Toll样受体（Tlr）通路，同时增强了SRY-Box转录因子9（Sox9）和软骨细胞外基质基因。结果表明，炎症和LEF1依赖性软骨矿化之间存在联系，由Sirt1的失活介导。通过在PTOA模型中敲除Lef1，OA的结构和疼痛相关表型得到减轻，部分是通过防止外侧关节腔的软骨矿化，部分是通过半月板组织的矿化。总的来说，这些数据提供了一个分子轴，将炎症与PTOA模型中的软骨联系起来[8]。

除了上述作用，LEF1还与急性髓细胞白血病（AML）中的表观遗传机制有关。研究发现，具有3q26病变的AML过表达转录因子（TF）EVI1，与AML的治疗耐药性和较差的总生存期相关。与CRISPR筛选强调BRD4依赖性一致，使用BET抑制剂（BETi）治疗抑制了EVI1、LEF1、c-Myc、c-Myb、CDK4/6和MCL1的表达，并诱导了具有3q26病变的AML细胞的凋亡。已知可以破坏核β-catenin和TCF7L2/LEF1与TBL1结合的Tegavivint（TV，BC-2059）也抑制了EVI1与TBL1的共定位，并以剂量依赖性方式诱导了具有3q26.2病变的AML细胞系和患者来源（PD）AML细胞的凋亡。TV治疗抑制了EVI1，减弱了ERG、TCF7L2、GATA2和MECOM位点的增强子活性，消除了MYC增强子之间的相互作用，抑制了AML的干性，同时上调了干扰素/炎症反应、TGF-β信号传导和凋亡调节的mRNA基因集。与TV和 BETi或维奈克拉联合治疗在体外诱导了协同的致死性，并减少了具有3q26.2病变的AML异种移植小鼠的AML负担，改善了生存期[9]。

此外，LEF1的表达还受到CASP8AP2和ZEB2-CtBP2的调控。研究发现，CTBP2和CASP8AP2的低表达与儿童B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的不良预后和复发的风险相关。这项研究旨在通过CASP8AP2与CtBP2和ZEB2的相互作用来研究CASP8AP2如何调节LEF1的表达。研究发现，CASP8AP2、ZEB2和CtBP2之间存在相互作用，并且在下调CASP8AP2的表达后观察到了CtBP2和ZEB2之间的相互作用。将野生型（包含ZEB2结合位点）或突变型（包含突变结合位点）的LEF1基因启动子序列插入到pGL3-basic质粒中，并使用双荧光素酶报告基因检测系统观察CASP8AP2、ZEB2和CtBP2如何调节LEF1基因的转录。研究结果表明，CASP8AP2、CtBP2和ZEB2都可以结合到LEF1基因的启动子区域，并降低LEF1启动子的荧光素酶活性。同时，在下调CASP8AP2后，ZEB2与LEF1启动子的相互作用显著减弱。在697细胞系中敲低CASP8AP2导致与干细胞相关的基因CD44、JAG1和SALL4的mRNA表达水平显著上调。总之，CASP8AP2对于CtBP2和ZEB2之间的相互作用至关重要，抑制LEF1和干细胞相关基因的表达[10]。

综上所述，LEF1是一个在多种生物学过程中发挥重要作用的转录因子。它在急性淋巴细胞白血病、胶质母细胞瘤、下丘脑神经发生、皮肤色素沉着、肝细胞癌、软骨矿化和急性髓细胞白血病中发挥着重要的调控作用。LEF1的表达受到非编码反义转录本的调控，并且与其他转录因子和信号通路相互作用。LEF1的研究有助于深入理解其在不同疾病中的作用机制，为疾病的治疗和预防提供新的思路和策略。