• 验证F1代flox鼠打靶是否正确

1. 引物设计

F1/R1验证5'arm打靶是否正确，F2/R2验证3'arm打靶是否正确，F4/R4验证插入区域。鉴定的阳性鼠继续进行Southern Blot的验证。

 

 

 

 

2. 预期片段大小

条带1的大小为：F1/R1扩增的5'arm端，包括野生型骨架区+同源臂+loxP+敲入区域；

条带2的大小为：F2/R2扩增的3'arm端，包括野生型骨架区+同源臂+loxP+敲入区域；

条带3的大小为：F4/R4扩增的插入片段。

 

备注：条带1和条带2是对同源臂骨架区的验证，片段一般是2Kb以上，扩增难度较大。

 

3. 电泳结果

若电泳结果同时有条带1、条带2、条带3，则为阳性flox鼠；

若没有扩增出目的条带的则为阴性鼠（野生型或其它突变）。

 

 

 

4. 测序

除了PCR鉴定，还需要将产物送测确认。F1/R1扩增产物的测序引物设在靠近loxP位点的5’arm上（图示中的F3），F2/R2扩增产物的测序引物设在靠近loxP位点的3’arm上（图示中的R3）。

 

 

 

• flox鼠的基因型鉴定

1. 引物设计

交付的F1代小鼠已验证过同源臂打靶的正确性，现只需通过验证目的基因小于1 Kb的片段即可，一般设计在特异性好的loxP附近。

 

 

2. 预期片段大小：

条带1的大小为：F5/R5扩增的5'arm端的野生型；

条带2的大小为：F6/R6扩增的5'arm端的同源臂+loxP+敲入区域；

 

3. 结果：

若电泳结果只有条带1，则判断为野生鼠（+/+）；

若电泳结果只有条带2，则判断为阳性纯合鼠（flox/flox）；

若电泳结果有条带1和条带2，则为阳性杂合鼠（flox/+）。

 

 

 

• 鉴定Cre鼠删除效率

纯合或杂合flox鼠与Cre鼠交配的后代需要鉴定删除效率，验证是否发生删除需要先鉴定Cre基因，若鼠尾为Cre阳性再取特异性组织进行验证。

 

1. 引物设计

在5'arm与3'arm上设计引物，位于CKI区域的上/下游。

 

 

 

2. 预期片段大小

条带1的大小为：F6/R7扩增的打靶载体片段大小；

条带2的大小为：F6/R7扩增的删除后的片段大小；

条带3的大小为：F6/F6扩增的5'arm端,同源臂+loxP+部分敲入区域；

条带4的大小为：F5/F5扩增的5'arm端,野生型；

 

注：F6/R7可能会因片段太大或者基因组的提取效果差而扩增不出条带。

 

3. 结果

若电泳结果只有条带2，则判断为CKI纯合子（即2条染色体均发生删除）；

若电泳结果有条带2和条带4，则判断为CKI杂合子（即1条染色体发生删除）；

若电泳结果有条带1或者条带3，则可能是由于Cre删除效率低，loxp之间的区域没有发生删除。