验证F1代flox鼠打靶是否正确
1. 引物设计
F1/R1验证5'arm打靶是否正确，F2/R2验证3'arm打靶是否正确，F5/R5、F6/R6验证两端loxP位点。鉴定为阳性的鼠继续进行Southern Blot的验证。
2. 预期片段大小
条带1的大小为：F1/R1扩增的5'arm端，包括野生型骨架区+同源臂+loxP+部分敲除区域；
条带2的大小为：F2/R2扩增的3'arm端，包括野生型骨架区+同源臂+loxP+部分敲除区域；
条带3的大小为：F5/R5扩增的5'arm端，同源臂+loxP+部分敲除区域；
条带4的大小为：F6/R6扩增的3'arm端，同源臂+loxP+部分敲除区域。
备注：条带1和条带2是对同源臂骨架区的验证，片段一般是2Kb以上，扩增难度较大。赛业在交付之前会进行验证，您可以无需再进行验证。
3. 电泳结果
若电泳结果同时有条带1、条带2、条带3、条带4，则为阳性flox鼠；
若没有扩增出目的条带的则为阴性鼠（野生型或其它突变）。
4. 测序
除了PCR鉴定，还需要将产物送测确认。F1/R1扩增产物的测序引物设在靠近loxP位点的5’arm上（图示中的F3），F2/R2扩增产物的测序引物设在靠近loxP位点的3'arm上（图示中的F4）。
二、F2代flox鼠的纯杂合鉴定
1. 引物设计
交付F1代阳性小鼠已验证过同源臂打靶的正确性，其自交产生的后代只需通过验证小于1kb的目的片段即可，一般设计在特异性好的loxP附近。
2. 预期片段大小
条带1的大小为：F5/R5扩增的5'arm端，同源臂+loxP+部分敲除区域；
条带2的大小为：F5/R5扩增的5'arm端，野生型；
条带3的大小为：F6/R6扩增的3'arm端，同源臂+loxP+部分敲除区域；
条带4的大小为：F6/R6扩增的3'arm端，野生型；
备注：F5/R5、F6/R6两对引物选取其中一对验证即可。
3. 结果
若电泳结果只有条带1或者条带3，则判断为阳性纯合鼠（-/-）；
若电泳结果只有条带2或者条带4，则判断为野生鼠（+/+）；
若电泳结果有条带1和条带2或者条带3和条带4，则为阳性杂合鼠（+/-）。
三、鉴定Cre鼠删除效率
纯合或杂合flox鼠与Cre鼠交配的后代需要鉴定删除效率，验证是否发生删除。验证删除效率前需要先鉴定Cre基因，若鼠尾为Cre阳性再取特异性组织进行验证。
1. 引物设计
在5'arm与3'arm上设计引物，位于CKO区域的上/下游。
2. 预期片段大小
条带1的大小为：F5/R7扩增的打靶载体片段；
条带2的大小为：F5/R7扩增的删除后的片段；
条带3的大小为：F5/R5扩增的5'arm端,同源臂+loxP+部分敲除区域；
条带4的大小为：F5/R5扩增的5'arm端,野生型。
注：F5/R7可能会因片段太大或者基因组的提取效果差而扩增不出条带。
3. 结果
若电泳结果只有条带2，则判断为CKO纯合子（即2条染色体均发生删除）；
若电泳结果有条带2和条带4，则判断为CKO杂合子（即1条染色体发生删除）；
若电泳结果有条带1或条带3，则可能是由于Cre删除效率低，CKO区域没有发生删除。
注：电泳结果可能会出现其他删除不完全的结果，这与CRE鼠的删除效率有关，也与实验取材有关，比如删除是发生在内皮细胞，但是取材不是特别精细，含有其他组织就会影响结果的判断。
