1. 引物设计
将引物设计在敲除区域的两端,即F1和R2引物,通过条带大小判断基因型。
2. 预期片段大小
条带1的大小为:F1/R1扩增的野生型片段减去敲除片段;
条带2的大小为:F1/R1扩增的野生型片段;
注:如果不精提基因组或不使用高保真高扩增效率的聚合酶,一般大于2kb的条带会较难扩增。图示中敲除区域大于2kb时,野生型扩增不出条带,即无条带2。
3. 电泳结果
若电泳结果只有条带1,则判断为阳性纯合鼠(-/-);
若电泳结果只有条带2,则判断为野生鼠(+/+);
若电泳结果有条带1和条带2,则为阳性杂合鼠(+/-)。
注:若条带2无法扩增,扩增出条带1只能判定为阳性鼠(杂合或者纯合)。
三条引物进行基因型鉴定
1. 引物设计
若是所用的酶可以扩增出野生型的片段,用上文中的F/R这对引物就可以鉴定出纯杂合。但当敲除的片段过大,而所用的酶无法扩增出野生型的条带时,F/R这对引物是不能区分F2代的纯杂合,所以需要再设计一条位于敲除区域内的引物,使用3条引物用短片段体系即可判断基因型。
2. 预期片段大小
条带1的大小为:F1/R1扩增的野生型片段减去敲除片段;
条带3的大小为:F1/R2扩增的野生型片段;
3. 电泳结果
若电泳结果只有条带1,则判断为阳性纯合鼠(-/-);
若电泳结果只有条带3,则判断为野生鼠(+/+);
若电泳结果有条带1和条带3,则为阳性杂合鼠(+/-)。
注:以上实验可以3条引物放在一个体系中扩增,也可以分为2个体系进行扩增。目的扩增片段一般都小于1kb,使用短片段体系即可。另,如果两对引物预期片段大小相差仅几十bp,在有实验误差的情况下,同一胶图可能较难区分两条条带,建议分成2个体系进行扩增,先判断是否阳性,再进一步判断纯杂合。